Testování DNA (také nazývané Genetické snímání otisků prstů, typizace DNA nebo profilování DNA) je technika používaná k rozlišení jedinců stejného druhu za použití pouze vzorků jejich DNA. Její vynález Dr. Alec Jeffreys z Univerzity v Leicesteru byl oznámen v roce 1984. Dva lidé budou mít drtivou většinu sekvencí své DNA společnou. Genetické snímání otisků prstů využívá vysoce variabilní opakující se sekvence zvané minisatelity. U dvou nepříbuzných lidí bude nepravděpodobné, že budou mít stejný počet minisatelitů na daném místě. Při STR profilování, které je odlišné od DNA snímání otisků prstů, se PCR používá k získání dostatečného množství DNA k následnému zjištění počtu opakování na několika místech. Je možné stanovit shodu, která je krajně nepravděpodobná, že vznikla shodou okolností, s výjimkou případu identických dvojčat, která budou mít identické genetické profily. Ale ne otisky prstů.
Genetický otisk prstů se používá ve forenzních vědách, aby se podezřelí shodovali se vzorky krve, vlasů, slin nebo spermatu. Vedl také k několika zproštěním viny dříve odsouzených podezřelých. Používá se také v takových aplikacích, jako je identifikace lidských ostatků, testování otcovství, srovnávání dárců orgánů, studium populací volně žijících zvířat a stanovení provincie nebo složení potravin. Používá se také k vytváření hypotéz o struktuře lidské diaspory v prehistorických dobách.
Identifikace DNA musí být provedena extrakcí DNA z látek, jako jsou:
Referenční vzorky se často odebírají pomocí stěru bukální sliznice.
Metody snímání otisků DNA
DNA otisk začíná extrakcí DNA z buněk ve vzorku krve, slin, spermatu nebo jiné vhodné tekutiny nebo tkáně.
Jeden ze způsobů, jak získat DNA otiskem prstu, je udělat jižanskou kaňku. To má několik kroků. Nejdříve musí být analyzovaná DNA oddělena od jiného materiálu. Dále musí být rozřezána na několik různě velkých kousků pomocí restrikčních enzymů, proteinů, které dokážou rozříznout dvouvláknovou DNA bez poškození bází. Kousky jsou roztříděny podle velikosti pomocí gelové elektroforézy. Kousky se nalijí do gelu s kladným nábojem na dně. DNA má přirozený mírně záporný náboj, takže bude přitahována ke dnu. Menší kousky se mohou gelem pohybovat rychleji, proto budou dále ke dnu než větší kousky. Tím se oddělí kousky podle velikosti, přičemž ty větší jsou výše a ty menší níže. Dále se na gel aplikuje alkalický roztok nebo teplo, takže DNA denaturuje a odděluje se do jednotlivých vláken. Papír z nitrocelulózy se rovnoměrně přitlačí na gel a pak se peče, aby se na něj DNA trvale navázala. DNA je nyní připravena k analýze pomocí radioaktivní sondy v hybridizační reakci.
K výrobě radioaktivní sondy je potřeba DNA polymeráza. DNA, která se má stát radioaktivní, by měla být vložena do zkumavky. Podél vlákna by měly být vytvořeny horizontální zlomy, zároveň by měly být přidány nukleotidy. Báze C, neboli cytosin, by měla být radioaktivní. Dále by měla být do zkumavky přidána polymeráza. Ta bude přitahována k zlomům a pokusí se je opravit. Jak DNA polymeráza fixuje DNA, rozbije stávající vazby tak, aby stávající nukleotidy mohly být nahrazeny novými nukleotidy v zkumavce. Kdykoli má spodní vlákno G bázi, neboli guanin, vložené C bude radioaktivní. Opravením vlákna DNA se polymeráza také stane radioaktivní. DNA se zahřeje tak, aby se oba řetězce rozdělily. Vytvoří se jednovláknové kusy, které mohou, ale nemusí být radioaktivní. Radioaktivní kusy jsou nyní připraveny k použití.
Nyní může být radioaktivní sonda použita k vytvoření hybridizační reakce. Hybridizace je, když se dvě genetické sekvence spojí kvůli vodíkovým vazbám, které jsou mezi páry bází. Dvě z těchto vazeb jsou mezi A, nebo adeninem, a T, nebo thyminem, a tři mezi C a G. Aby hybridizace fungovala, musí být DNA denaturována tak, aby byla jednovláknová; jako Southern Blot, který byl vyroben na nitrocelulózovém papíru. denaturovaná DNA a radioaktivní sonda by měly být vloženy do plastového sáčku se solnou tekutinou a pak protřepány. Sonda se naváže na denaturovanou DNA všude tam, kde najde záchvat. Sonda a DNA do sebe nemusí přesně zapadat. Obě budou mít sekvence, které mohou držet pohromadě, i když záchvat bude špatný, nicméně vodíkových vazeb bude méně. Sondy, které mají nízkou homologii, nebo podobnost, se mohou lépe vázat na DNA, pokud se mění teplota nebo se mění množství soli ve směsi. I když záchvat je špatný, sonda a DNA jsou nyní hybridizovány.
Způsob, jak využít celý výše popsaný proces, je použít ho k určení VNTR dané osoby. VNTR neboli variabilní počet opakování Tandem jsou opakované sekvence párů bází v něčí genetické informaci. Každý řetězec DNA obsahuje exony nebo sekce, které mají genetickou informaci, a introny, které nemají jiné rozpoznatelné použití než obsahující VNTR nebo opakující se sekvence párů bází. Každá jednotlivá lidská bytost má několik těchto opakujících se sekvencí. Aby se zjistilo, zda má někdo konkrétní VNTR, musí se udělat Southern Blot a pak se sonduje v hybridizační reakci radioaktivní verzí zmíněného VNTR. Tento proces končí vytvořením vzoru zvaného DNA otisk prstu. Každý člověk má VNTR, které zdědil geneticky po jednom nebo obou rodičích. Je nemožné, aby ho někdo měl, který neměl ani jeden z jejich rodičů. VNTR vzory jsou pro každou osobu jedinečné a budou přesnější, pokud se použije více VNTR sond.
S vynálezem polymerázové řetězové reakce (PCR) otisky DNA učinily obrovský pokrok jak v rozlišující síle, tak ve schopnosti obnovit informace z velmi malých počátečních vzorků. PCR zahrnuje amplifikaci specifických oblastí DNA pomocí cyklování teploty a termostabilní polymerázové enzymu spolu s flourescentně označenými sekvenčními specifickými primery DNA. K dispozici se staly komerční sady, které používaly jednonukleotidové polymorfismy (SNP) pro diskriminaci. Tyto sady používají PCR k amplifikaci specifických oblastí se známými variacemi a jejich hybridizaci do sond ukotvených na kartách, což má za následek barevnou skvrnu odpovídající konkrétní sekvenční variaci.
Jednou z hlavních stížností proti RFLP bylo, že byla pomalá a vyžadovala použití velkého množství DNA. To vedlo k vývoji metod založených na PCR, které vyžadovaly menší množství DNA, která mohla být také více degradována než ty, které byly použity při analýze RFLP. Systémy jako HLA-DQ alfa reverzní tečkové blotové proužky se staly velmi populární díky jejich snadnému použití a rychlosti, s jakou bylo možné získat výsledek, nicméně nebyly tak diskriminační jako RFLP. Bylo také obtížné určit profil DNA pro smíšené vzorky, jako je vaginální výtěr oběti sexuálního napadení.
Další technika, AmpFLP, neboli polymorfismus délky amplifikovaného fragmentu, byla také uvedena do praxe na začátku 90. let. Tato technika byla také rychlejší než RFLP analýza a používala PCR k amplifikaci vzorků DNA. Spoléhala se na polymorfismy tandemu s proměnným počtem (VNTR) k rozlišení různých alel, které byly odděleny na polyakrylamidovém gelu pomocí alelického žebříku (na rozdíl od žebříku molekulární hmotnosti). Pásy mohly být vizualizovány stříbrným barvením gelu. Jedním z oblíbených lokusů pro snímání otisků prstů byl lokus D1S80. Stejně jako u všech metod založených na PCR může vysoce degradovaná DNA nebo velmi malé množství DNA způsobit alelické vypadávání (což způsobí chybu v domnění, že heterozygot je homozygot) nebo jiné stochastické účinky. Navíc, protože se analýza provádí na gelu, může se velmi vysoký počet opakování shlukovat na vrcholu gelu, což ztěžuje jeho vyřešení. Analýza AmpFLP může být vysoce automatizovaná a umožňuje snadnou tvorbu fylogenetických stromů na základě porovnání jednotlivých vzorků DNA. Díky relativně nízkým nákladům a snadnému nastavení a provozu zůstává AmpFLP populární v zemích s nižšími příjmy.
Nejrozšířenější metoda otisku DNA používaná dnes je založena na PCR a používá krátké tandemové opakování (STR). Tato metoda používá vysoce polymorfní oblasti, které mají krátké opakované sekvence DNA (nejčastěji se opakují 4 báze, ale používají se i jiné délky, včetně 3 a 5 bází). Vzhledem k tomu, že různí lidé mají různý počet opakovaných jednotek, mohou být tyto oblasti DNA použity k rozlišení mezi jednotlivci. Tyto STR lokusy (lokusy) jsou cíleny na sekvenční primery a jsou amplifikovány pomocí PCR. Výsledné fragmenty DNA jsou pak odděleny a detekovány pomocí elektroforézy. Existují dvě běžné metody separace a detekce, kapilární elektroforéza (CE) a gelová elektroforéza.
Polymorfismy zobrazené v každé oblasti STR jsou samy o sobě velmi časté, typicky každý polymorfismus sdílí přibližně 5 – 20% jedinců. Při pohledu na více lokusů je to právě unikátní kombinace těchto polymorfismů k jedinci, co činí tuto metodu diskriminující jako identifikační nástroj. Čím více oblastí STR, které jsou testovány u jedince, tím více se test stává diskriminující.
V jednotlivých zemích se používají různé systémy profilování DNA založené na STR. V Severní Americe jsou systémy, které zesilují základní lokusy CODIS 13, téměř univerzální, zatímco ve Spojeném království je používán systém SGM+, který je kompatibilní s používanou národní databází DNA. Ať je použit jakýkoli systém, mnoho testovaných oblastí STR je stejných. Tyto systémy profilování DNA jsou založeny na multiplexních reakcích, kdy mnoho oblastí STR bude testováno současně.
Kapilární elektroforéza funguje tak, že elektrokineticky (pohyb prostřednictvím aplikace elektrického pole) vstřikuje fragmenty DNA do tenké skleněné trubice (kapiláry) naplněné polymerem. DNA je protažena trubicí pomocí elektrického pole, oddělující fragmenty tak, aby menší fragmenty cestovaly kapilárou rychleji. Fragmenty jsou pak detekovány pomocí fluorescenčních barviv, která byla připojena k primerům používaným v PCR. To umožňuje, aby bylo více fragmentů zesíleno a spuštěno současně, což se nazývá multiplexing. Velikosti jsou přiřazovány pomocí značených standardů velikosti DNA, které jsou přidávány ke každému vzorku, a počet opakování je určen porovnáním velikosti s alelickým žebříkem, vzorkem, který obsahuje všechny běžné možné velikosti opakování. Ačkoli je tato metoda drahá, používají se stroje s větší kapacitou s vyšší propustností, aby se snížily náklady/vzorek a snížily se nedodělky, které existují v mnoha vládních kriminálních zařízeních.
Gelová elektroforéza funguje na podobných principech jako CE, ale místo kapiláry se používá velký polyakrylamidový gel, který odděluje fragmenty DNA. Aplikuje se elektrické pole, jako v CE, ale místo toho, aby všechny vzorky proběhly detektorem, nejmenší fragmenty se provedou těsně u dna gelu a celý gel se naskenuje do počítače. Tím vznikne obraz zobrazující všechny pásy odpovídající různým velikostem opakování a alelický žebřík. Tento přístup nevyžaduje použití velikostních standardů, protože alelický žebřík je veden vedle vzorků a slouží tomuto účelu. Vizualizace může probíhat buď použitím fluorescenčně značených barviv v primerech nebo stříbrným barvením gelu před skenováním. Ačkoli je to nákladově efektivní a může to být dosti vysoce výkonné, stříbrné barvicí soupravy pro STR se přestávají vyrábět. Navíc mnoho laboratoří postupně odstraňuje gely ve prospěch CE, protože náklady na stroje se stávají lépe zvládnutelnými.
Skutečná síla STR analýzy je v její statistické síle diskriminace. V USA existuje 13 core loci (umístění DNA), které se v současnosti používají pro diskriminaci v CODISu. Protože tyto loci jsou nezávisle roztříděné (mít určitý počet opakování na jednom lokusu nemění pravděpodobnost, že bude mít nějaký počet opakování na jakémkoliv jiném lokusu), lze aplikovat produktové pravidlo pro pravděpodobnosti. To znamená, že pokud má někdo typ DNA ABC, kde tři loci byly nezávislé, můžeme říci, že pravděpodobnost, že bude mít tento typ DNA, je pravděpodobnost, že bude mít typ A krát pravděpodobnost, že bude mít typ B krát pravděpodobnost, že bude mít typ C. To má za následek schopnost generovat pravděpodobnosti shody 1 v kvintilionu (1 s 18 nulami za ním) nebo více.
Alespoň taková je teorie. Problém je v tom, že my lidé se nepáříme náhodně. V rámci příslušné malé subpopulace by se pravděpodobnosti různých typů mohly velmi velmi lišit od toho, jaké jsou v celé populaci. Místo toho, abychom společně vynásobili třináctinásobek malé pravděpodobnosti a vyšla nám jedna v kvintilionu, měli bychom pravděpodobně společně vynásobit třináctinásobek docela velké, ale zcela neznámé pravděpodobnosti – výsledkem je něco kolem 1 ku 10, nebo 1 ku tisíci? To nikdo neví. V současné době panuje mezi vědci velká obava, že nepochopení důkazů DNA mezi policií, právníky a soudci už způsobilo vážné justiční omyly v mnoha zemích. Důkazy DNA jsou užitečné pro prokázání, že někdo nemohl být vinen (když máte neshodu), ale jejich hodnota při dokazování, že někdo je vinen, je v podstatě pochybná a neznámá.
Nedávné inovace zahrnovaly vytvoření primerů zaměřených na polymorfní oblasti na Y-chromozomu (Y-STR), které umožňují rozlišení více mužských profilů, nebo případy, kdy diferenciální extrakce není možná. Y-chromozomy jsou otcovsky dědičné, takže Y-STR analýza může pomoci při identifikaci otcovsky příbuzných mužů. Y-STR analýza byla provedena v rámci sporu o Sally Hemingsovou, aby se zjistilo, zda Thomas Jefferson zplodil syna s jedním ze svých otroků.
U vysoce degradovaných vzorků je někdy nemožné získat kompletní profil 13 CODIS STR. V těchto situacích je mitochondriální DNA (mtDNA) někdy typována kvůli tomu, že je v buňce mnoho kopií mtDNA, zatímco může být pouze 1-2 kopie jaderné DNA. Forenzní vědci amplifikují HV1 a HV2 oblasti mtDNA, poté sekvencují každou oblast a porovnávají jednotlivé nukleotidové rozdíly s referencí. Protože mtDNA je mateřsky dědičná, mohou být přímo příbuzní matky použiti jako srovnávací reference, například syn babičky z matčiny strany. Rozdíl dvou nebo více nukleotidů je obecně považován za vyloučení. Heteroplasmie a poly-C rozdíly mohou rozhodit přímá sekvenční srovnání, takže je nutná určitá odbornost ze strany analytika. mtDNA je užitečná při určování nejasných identit, například totožnosti pohřešovaných osob, pokud lze nalézt příbuzného s matkou. mtDNA testy byly použity při určování, že Anna Andersonová není ruskou princeznou, za kterou se vydávala, Anastasií Romanovovou.
mtDNA lze získat z takových materiálů, jako jsou vlasové hřídele a staré kosti/zuby.
Úvahy při hodnocení důkazů DNA
Při použití RFLP je teoretické riziko náhodné shody 1 ku 100 miliardám (100 000 000 000). Nicméně míra laboratorní chyby je téměř jistě vyšší než tato a často skutečné laboratorní postupy neodrážejí teorii, podle které byly vypočteny pravděpodobnosti shody. Například pravděpodobnost shody může být vypočtena na základě pravděpodobnosti, že markery ve dvou vzorcích mají pásma přesně na stejném místě, ale laboratorní pracovník může dojít k závěru, že podobné – ale ne přesně identické – vzory pásem vyplývají z identických genetických vzorků s určitou nedokonalostí v agarózovém gelu. Nicméně v tomto případě laboratorní pracovník zvyšuje riziko shody rozšířením kritérií pro deklarování shody. Nedávné studie uvádějí relativně vysokou míru chyb, které mohou být důvodem k obavám . V počátcích genetického snímání otisků prstů byly potřebné populační údaje pro přesný výpočet pravděpodobnosti shody někdy nedostupné. Mezi lety 1992 a 1996 byly svévolně nízké stropy kontroverzně kladeny na pravděpodobnosti shody používané v analýze RFLP spíše než na vyšší teoreticky vypočtené . Dnes se RFLP stala široce nepoužívanou kvůli nástupu více diskriminujících, citlivých a snadnějších technologií.
Při hodnocení shody DNA je třeba položit následující otázky:
Hodnotu důkazu DNA je třeba vidět ve světle nedávných případů, kdy zločinci podstrčili na místa činu falešné vzorky DNA. V jednom případě dokonce zločinec podstrčil falešný důkaz DNA do vlastního těla: Dr. John Schneeberger z Kanady v roce 1992 znásilnil jednu ze svých pacientek pod sedativy a nechal sperma na jejím spodním prádle. Policie odebrala Schneebergerovi krev a třikrát porovnala jeho DNA se spermatem z místa činu, ale nikdy neprokázala shodu. Ukázalo se, že si chirurgicky vložil do ruky Penroseův drenáž a naplnil ji cizí krví a antikoagulanty.
Důkazy DNA jako důkaz v trestních procesech
Členové poroty, pokud přijmete vědecké důkazy povolané Korunou, znamená to, že ve Spojeném království jsou pravděpodobně jen čtyři nebo pět bělochů, od kterých mohla pocházet tato skvrna od spermatu. Žalovaný je jedním z nich. Pokud je tomu tak, rozhodnutí, ke kterému musíte dospět, ohledně všech důkazů, je, zda jste si jisti, že to byl obžalovaný, kdo zanechal tuto skvrnu, nebo zda je možné, že to byl někdo z té malé skupiny mužů, kteří mají stejné charakteristiky DNA.
Poroty by měly zvažovat protichůdné a potvrzující důkazy za použití vlastního zdravého rozumu a ne za použití matematických vzorců, jako je Bayesova věta, aby se předešlo „zmatení, nedorozumění a chybnému úsudku“.
Prezentace a hodnocení průkaznosti částečných nebo neúplných profilů DNA
R v Bates (2006) EWCA Crim 1395 Moore-Bick LJ řekl:
Ve dvacátých letech Anna Andersonová tvrdila, že je velkokněžna Anastasia Romanovová ruská; v osmdesátých letech po její smrti byly vzorky její tkáně, které byly po lékařském zákroku uloženy v nemocnici v Charlottesville ve Virginii, testovány pomocí DNA otisků prstů a ukázalo se, že nemá žádný vztah k Romanovcům.
V roce 1987 byl britský pekař Colin Pitchfork prvním zločincem, který byl dopaden za použití DNA otisků prstů v Leicesteru, městě, kde byl poprvé objeven.
V roce 1987 byl násilník z Floridy Tommie Lee Andrews jako první člověk ve Spojených státech odsouzen na základě důkazů DNA za znásilnění ženy během vloupání; odsouzen byl 6. listopadu 1987 a odsouzen k 22 letům vězení.
V roce 1988 byl Timothy Spencer jako první muž ve Spojených státech odsouzen k trestu smrti testováním DNA za několik obvinění ze znásilnění a vraždy, přezdívalo se mu „Jižanský škrtič“, protože zabil všechny své oběti na jižní straně Richmondu ve Virginii. Později byl obviněn ze znásilnění a vraždy 1. stupně a byl odsouzen k trestu smrti. Byl popraven 27. dubna 1994.
V roce 1989 byl Chicagský muž Gary Dotson první osobou, jejíž odsouzení bylo zrušeno pomocí důkazů DNA.
V roce 1991 byl Allan Legere jako první Kanaďan odsouzen na základě důkazů DNA za čtyři vraždy, které spáchal jako uprchlý vězeň v roce 1989. Během procesu jeho obhajoba tvrdila, že relativně mělký genofond regionu může vést k falešným pozitivům.
V roce 1992 byly použity důkazy DNA, které dokazovaly, že nacistický lékař Josef Mengele byl pohřben v Brazílii pod jménem Wolfgang Gerhard.
V roce 1993 byl Kirk Bloodsworth jako první člověk usvědčen z vraždy a odsouzen k trestu smrti, jehož odsouzení bylo pomocí důkazů DNA zrušeno.
Věda se proslavila ve Spojených státech v roce 1994, kdy se prokurátoři silně opírali – a prostřednictvím odborných svědků vyčerpávajícím způsobem prezentovali a vysvětlovali – o důkazy DNA, které údajně spojovaly O.J. Simpsona s dvojnásobnou vraždou. Případ také vynesl na světlo laboratorní potíže a nešťastné náhody při manipulaci, které mohou způsobit značné pochybnosti o takových důkazech.
V roce 1994 detektivové RCMP úspěšně otestovali vlasy kočky známé jako Snowball a pomocí testu spojili muže s vraždou jeho ženy, čímž poprvé v historii forenzního výzkumu označili použití nelidské DNA k identifikaci zločince.
V roce 1998 byl Dr. Richard J. Schmidt odsouzen za pokus o vraždu druhého stupně, když se ukázalo, že existuje spojitost mezi virovou DNA viru lidské imunodeficience (HIV), ze které byl obviněn, že ji píchal své přítelkyni, a virovou DNA jednoho ze svých pacientů s plně rozvinutou AIDS. Bylo to poprvé, kdy byly virové DNA otisky prstů použity jako důkaz v trestním řízení.
V roce 1999 byl Raymond Easton postižený muž ze Swindonu v Anglii zatčen a zadržen na 7 hodin v souvislosti s vloupáním kvůli nepřesné shodě DNA. Jeho DNA byla uchována ve spisu po nesouvisejícím domácím incidentu před nějakou dobou.
V roce 2002 byly testy DNA použity k očištění Douglase Echolse, muže, který byl neprávem odsouzen v případu znásilnění v roce 1986. Echols byl 114. osobou, která byla zproštěna viny pomocí testů DNA po odsouzení.
V srpnu 2002 byla Annalisa Vincenziová zastřelena v Toskánsku. O něco později byl třiadvacetiletý barman Peter Hamkin v březnu 2003 zatčen v Merseyside na základě příkazu k vydání, který byl vyslechnut u soudu v Bow Street v Londýně, aby se zjistilo, zda by měl být převezen do Itálie, kde by čelil obvinění z vraždy. DNA „prokázala“, že ji zastřelil, ale byl očištěn na základě jiných důkazů.
V roce 2003 byl Welšan Jeffrey Gafoor odsouzen za vraždu Lynette Whiteové z roku 1988, kdy byly důkazy z místa činu shromážděné o 12 let dříve znovu prozkoumány pomocí technik STR, což vedlo ke shodě s jeho synovcem. Může to být první známý příklad, kdy byla DNA nevinného, zatím spřízněného jedince použita k identifikaci skutečného zločince, a to prostřednictvím „rodinného vyhledávání“.
V červnu 2003, kvůli novým důkazům DNA, vyhráli Dennis Halstead, John Kogut a John Restivo opětovný proces kvůli jejich odsouzení za vraždu. Tito tři muži si již odseděli osmnáct let ze svých více než třiceti ročních trestů.
Proces s Robertem Picktonem je pozoruhodný tím, že důkazy DNA se používají především k identifikaci obětí a v mnoha případech k prokázání jejich existence.
V březnu 2003 byl Josiah Sutton propuštěn z vězení poté, co si odpykal čtyři roky z dvanáctiletého trestu za obvinění ze sexuálního napadení. Pochybné vzorky DNA odebrané ze Suttona byly znovu otestovány v návaznosti na skandál kriminální laboratoře houstonského policejního oddělení s chybným zacházením s důkazy DNA.
V prosinci 2005 bylo prokázáno, že Evan Simmons je nevinný z útoku na ženu z Atlanty z roku 1981 poté, co si odpykal čtyřiadvacet let ve vězení. Pan Clark je 164. osobou ve Spojených státech a pátou v Gruzii, která byla osvobozena pomocí testů DNA po odsouzení.