Nikotinamid adenindinukleotid, zkráceně NAD+, je koenzym, který se nachází ve všech živých buňkách. Tato sloučenina je dinukleotid, protože se skládá ze dvou nukleotidů spojených prostřednictvím jejich fosfátových skupin: přičemž jeden nukleotid obsahuje adeninovou bázi a druhý nikotinamid.
V metabolismu se NAD+ podílí na redoxních reakcích, přenáší elektrony z jedné reakce do druhé. Koenzym se proto v buňkách vyskytuje ve dvou formách: NAD+ je oxidační činidlo – přijímá elektrony z jiných molekul a redukuje se, touto reakcí vzniká NADH, který pak může být použit jako redukční činidlo k darování elektronů. Tyto reakce přenosu elektronů jsou hlavní funkcí NAD+. Používá se však i v jiných buněčných procesech, zejména jako substrát enzymů, které přidávají nebo odstraňují chemické skupiny z proteinů, v posttranslačních modifikacích. Vzhledem k důležitosti těchto funkcí jsou enzymy podílející se na metabolismu NAD+ cílem pro objev léčiv.
V organismech může být NAD+ syntetizován od nuly (de novo) z aminokyselin tryptofanu nebo kyseliny asparagové. Alternativně jsou složky koenzymů přijímány z potravy jako vitamín zvaný niacin. Podobné sloučeniny jsou uvolňovány reakcemi, které rozkládají strukturu NAD+. Tyto preformované složky pak procházejí záchrannou cestou, která je recykluje zpět do aktivní formy. Některé NAD+ se také přeměňují na nikotinamid adenindinukleotid fosfát (NADP+); chemie tohoto příbuzného koenzymu je podobná jako u NAD+, ale má jiné role v metabolismu.
Fyzikální a chemické vlastnosti
Nikotinamid adenin dinukleotid, stejně jako všechny dinukleotidy, se skládá ze dvou nukleotidů spojených dvojicí překlenovacích fosfátových skupin. Nukleotidy se skládají z ribózových kruhů, jeden s adeninem připojeným k prvnímu atomu uhlíku (poloha 1) a druhý s nikotinamidem v této poloze. Nikotinamidová skupina může být připojena ve dvou směrech k tomuto anomernímu atomu uhlíku, vzhledem k těmto dvěma možným strukturám, sloučenina existuje jako dva diastereomery. Je to β-nikotinamidový diastereomer NAD+, který se nachází v organismech. Tyto nukleotidy jsou spojeny mostem dvou fosfátových skupin přes 5′ uhlíky.
Redoxní reakce nikotinamidu adenindinukleotidu.
Při metabolismu sloučenina přijímá nebo daruje elektrony v redoxních reakcích. Takové reakce (shrnuté ve vzorci níže) zahrnují odstranění dvou atomů vodíku z reaktantu (R) ve formě hydridového iontu a protonu (H+). Proton se uvolňuje do roztoku, zatímco redukční RH2 se oxiduje a NAD+ se redukuje na NADH přenosem hydridu do nikotinamidového kruhu.
Z páru hydridových elektronů se jeden elektron přenese do kladně nabitého dusíku nikotinamidového kruhu NAD+, a druhý atom vodíku se přenese do uhlíkového atomu C4 naproti tomuto dusíku. Střední potenciál páru NAD+/NADH redox je −0,32 voltů, což z NADH dělá silné redukční činidlo. Reakce je snadno vratná, když NADH redukuje jinou molekulu a znovu se oxiduje na NAD+. To znamená, že koenzym může nepřetržitě kolovat mezi formami NAD+ a NADH, aniž by byl spotřebován.
Na pohled jsou všechny formy tohoto koenzymu bílé amorfní prášky, které jsou hygroskopické a vysoce rozpustné ve vodě. Pevné látky jsou stabilní, pokud jsou skladovány v suchu a ve tmě. Roztoky NAD+ jsou bezbarvé a stabilní asi týden při teplotě 4 °C a neutrálním pH, ale rychle se rozkládají v kyselinách nebo alkáliích. Při rozkladu vytvářejí produkty, které jsou inhibitory enzymů.
Absorpční spektra NAD+ a NADH.
NAD+ a NADH se také liší svou fluorescencí. NADH v roztoku má emisní vrchol 460 nm a životnost fluorescence 0,4 nanosekundy, zatímco oxidovaná forma koenzymu fluoreskuje. Vlastnosti fluorescenčního signálu se mění, když se NADH váže na proteiny, takže tyto změny mohou být použity k měření disociačních konstant, které jsou užitečné při studiu kinetiky enzymů. Tyto změny ve fluorescenci se také používají k měření změn v redoxním stavu živých buněk, prostřednictvím fluorescenční mikroskopie.
Koncentrace a stav v buňkách
V játrech potkanů je celkové množství NAD+ a NADH přibližně 1 μmol na gram vlhké hmotnosti, což je asi desetinásobek koncentrace NADP+ a NADPH ve stejných buňkách. Skutečnou koncentraci NAD+ v buněčném cytosolu je těžší změřit, nedávné odhady v živočišných buňkách se pohybují kolem 0,3 mM a přibližně 1,0 až 2,0 mM v kvasinkách. Přes 80% se však váže na bílkoviny, takže koncentrace v roztoku je mnohem nižší.
Údaje pro ostatní kompartmenty v buňce jsou omezené, i když v mitochondrionu je koncentrace NAD+ podobná koncentraci v cytosolu. Tento NAD+ je do mitochondrionu přenášen specifickým membránovým transportním proteinem, protože koenzym nemůže difundovat přes membrány.
Rovnováha mezi oxidovanými a redukovanými formami nikotinamidového adenindinukleotidu se nazývá poměr NAD+/NADH. Tento poměr je důležitou složkou toho, co se nazývá redoxní stav buňky, měření, které odráží jak metabolické aktivity, tak zdraví buněk. Účinky poměru NAD+/NADH jsou komplexní, kontrolují aktivitu několika klíčových enzymů, včetně glyceraldehyd 3-fosfát dehydrogenázy a pyruvát dehydrogenázy. Ve zdravých savčích tkáních se odhady poměru NAD+/NADH pohybují kolem 1, takže koncentrace NAD+ a NADH jsou zhruba srovnatelné. Naopak poměr NADP+/NADPH je normálně okolo 0,005, přibližně 200krát nižší než poměr NAD+/NADH, takže NADPH je dominantní formou tohoto koenzymu. Tyto rozdílné poměry jsou klíčové pro různé metabolické role NADH a NADPH.
NAD+ je syntetizován dvěma metabolickými cestami. Vyrábí se buď de novo cestou z aminokyselin, nebo v záchranných cestách recyklací preformovaných složek, jako je nikotinamid, zpět na NAD+.
Některé metabolické cesty, které syntetizují a konzumují NAD+ u obratlovců. Zkratky jsou definovány v textu.
Většina organismů syntetizuje NAD+ z jednoduchých složek. Specifický soubor reakcí se mezi organismy liší, ale společným rysem je tvorba kyseliny chinolové (QA) z aminokyseliny – buď tryptofanu (Trp) u zvířat a některých bakterií, nebo kyseliny asparagové u některých bakterií a rostlin. Kyselina chinolová se přeměňuje na mononukleotid kyseliny nikotinové (NaMN) přenosem fosforibové skupiny. Skupina adenylátů se pak přeměňuje na adenindinukleotid kyseliny nikotinové (NaAD). Skupina kyseliny nikotinové v NaAD se nakonec amiduje na nikotinamidovou (Nam) skupinu, čímž vzniká nikotinamidový adenindinukleotid.
Cesty záchrany používají tři prekurzory pro NAD+.
Kromě sestavení NAD+ de novo z jednoduchých prekurzorů aminokyselin buňky také zachraňují preformované sloučeniny obsahující nikotinamid. Ačkoli jsou známy i jiné prekurzory, třemi přírodními sloučeninami obsahujícími nikotinamidový kruh a používanými v těchto záchranných metabolických cestách jsou kyselina nikotinová (Na), nikotinamid (Nam) a nikotinamid ribosid (NR). Prekurzory jsou přiváděny do biosyntetické cesty NAD(P)+, jak je uvedeno výše, prostřednictvím adenylačních a fosforibosylačních reakcí. Tyto sloučeniny mohou být získány ze stravy, kde se směs kyseliny nikotinové a nikotinamidu nazývá vitamín B3 nebo niacin. Tyto sloučeniny jsou však také vytvářeny uvnitř buněk, když se nikotinamidová skupina uvolňuje z NAD+ v ADP-ribózových přenosových reakcích. Zdá se, že enzymy zapojené v těchto záchranných cestách jsou koncentrovány v buněčném jádře, což může kompenzovat vysokou úroveň reakcí, které konzumují NAD+ v této organele. Buňky mohou také převzít extracelulární NAD+ ze svého okolí.
Navzdory přítomnosti de novo dráhy jsou u lidí zásadní záchranné reakce; nedostatek niacinu ve stravě způsobuje onemocnění pellagrou z nedostatku vitamínů. Tento vysoký požadavek na NAD+ vyplývá z neustálé konzumace koenzymu v reakcích, jako jsou posttranslační modifikace, protože cyklování NAD+ mezi oxidovanými a redukovanými formami v redoxních reakcích nemění celkové hladiny koenzymu.
Záchranné cesty používané v mikroorganismech se liší od cest savců. Například některé patogeny, jako je kvasinka Candida glabrata a bakterie Haemophilus influenzae, jsou NAD+ auxotrofy – nemohou syntetizovat NAD+ a jsou závislé na záchranných cestách. Ještě překvapivější je intracelulární patogen Chlamydia trachomatis, který postrádá rozpoznatelné kandidáty pro jakékoli geny podílející se na záchraně nebo biosyntéze NAD+ i NADP+, a může místo toho tyto koenzymy zachránit ze svého hostitele.
Rossmannův ohyb v části laktátdehydrogenázy Cryptosporidium parvum ukazuje NAD+ v červené barvě, beta listy ve žluté a alfa helice ve fialové.
Nikotinamid adenin dinukleotid má několik zásadních rolí v metabolismu. Působí jako koenzym v redoxních reakcích, jako dárce ADP-ribózových skupin v ADP-ribosylačních reakcích, jako prekurzor molekuly druhého posla cyklické ADP-ribózy, stejně jako působí jako substrát pro bakteriální DNA ligázy a skupinu enzymů zvaných sirtuiny, které používají NAD+ k odstranění acetylových skupin z proteinů.
Při vazbě na protein se NAD+ a NADH obvykle drží uvnitř strukturního motivu známého jako Rossmannův záhyb. Motiv je pojmenován po Michaelu Rossmannovi, který byl prvním vědcem, který si všiml, jak běžná je tato struktura uvnitř proteinů vázajících nukleotidy. Tento záhyb obsahuje tři nebo více paralelních beta vláken spojených dvěma alfa helicemi v pořadí beta-alfa-beta-alfa-beta. To vytváří beta list lemovaný vrstvou alfa helicí na každé straně. Protože každý Rossmannův záhyb váže jeden nukleotid, vazebné domény pro dinukleotid NAD+ se skládají ze dvou párových Rossmannových záhybů, přičemž každý záhyb váže jeden nukleotid v rámci kofaktoru. Nicméně tento záhyb není univerzální mezi enzymy závislými na NAD, protože byla nedávno objevena třída bakteriálních enzymů podílejících se na metabolismu aminokyselin, které vážou koenzym, ale tento motiv postrádají.
Při vazbě v aktivním místě oxidoreduktázy je nikotinamidový kruh koenzymu umístěn tak, aby mohl přijmout hydrid z druhého substrátu. Vzhledem k tomu, že uhlík C4, který přijímá vodík, je prochirální, může to být využito v kinetice enzymu k získání informací o mechanismu enzymu. To se provádí smícháním enzymu se substrátem, který má atomy deuteria nahrazující vodíky, takže enzym sníží NAD+ přenosem deuteria, spíše než atomu vodíku. V tomto případě může enzym produkovat jeden ze dvou sterioisomerů NADH. V některých enzymech je vodík přenášen shora z roviny nikotinamidového kruhu, ty se nazývají oxidoreduktázy třídy A, zatímco enzymy třídy B přenášejí atom zdola.
Navzdory této podobnosti v tom, jak proteiny vážou koenzymy, vykazují enzymy téměř vždy vysokou úroveň specifičnosti buď pro NAD+ nebo NADP+. Tato specifičnost odráží odlišné metabolické role obou koenzymů a je výsledkem odlišných souborů aminokyselinových zbytků v obou typech kapsy vázající koenzymy. Například v aktivním místě enzymů závislých na NADP vzniká iontová vazba mezi postranním řetězcem základních aminokyselin a kyselou fosfátovou skupinou NADP+. Naopak u enzymů závislých na NAD je náboj v této kapse obrácený, což brání vazbě NADP+. Existuje však několik výjimek z tohoto obecného pravidla a enzymy jako aldosa reduktáza, glukosa-6-fosfát dehydrogenáza a methylenetetrahydrofolát reduktáza mohou u některých druhů používat oba koenzymy.
Zjednodušený nástin redoxního metabolismu, ukazující, jak NAD+ a NADH propojují cyklus kyseliny citronové a oxidativní fosforylaci.
Redoxní reakce katalyzované oxidoreduktázou jsou životně důležité ve všech částech metabolismu, ale zvláště důležitou oblastí, kde k těmto reakcím dochází, je uvolňování energie z živin. Zde se oxidují redukované sloučeniny, jako je glukóza, a tím se uvolňuje energie. Tato energie se přenáší na NAD+ redukcí na NADH, jako součást glykolýzy a cyklu kyseliny citronové. V eukaryotech se elektrony přenášené NADH, které vznikají v cytoplazmě glykolýzou, přenášejí do mitochondrionu mitochondriálními raketoplány, jako je raketoplán malat-aspartát. NADH se pak oxiduje elektronovým transportním řetězcem, který pumpuje protony přes membránu a vytváří ATP oxidativní fosforylací. Tyto raketoplány mají také stejnou transportní funkci v chloroplastech.
Vzhledem k tomu, že se v těchto propojených souborech reakcí používají jak oxidované, tak redukované formy nikotinamidového adenindinukleotidu, buňka si udržuje přibližně stejné koncentrace NAD+ a NADH; vysoký poměr NAD+/NADH umožňuje, aby tento koenzym působil jako oxidační i redukční činidlo. Naopak hlavní funkcí NADP+ je redukční činidlo v anabolismu, přičemž tento koenzym se podílí na cestách, jako je syntéza mastných kyselin a fotosyntéza. Vzhledem k tomu, že NADPH je potřebná k vyvolání redoxních reakcí jako silné redukční činidlo, je poměr NADP+/NADPH udržován na velmi nízké úrovni.
Ačkoli je NADH důležitý při katabolismu, používá se také při anabolických reakcích, jako je glukoneogeneze. Tato potřeba NADH v anabolismu představuje problém pro prokaryoty rostoucí na živinách, které uvolňují jen malé množství energie. Například nitrifikační bakterie, jako je Nitrobacter, oxidují nitrit na nitrát, který uvolňuje dostatek energie pro pumpování protonů a tvorbu ATP, ale ne tolik, aby produkoval NADH přímo. Protože NADH je stále potřebný pro anabolické reakce, tyto bakterie používají oxidoreduktázu nitritu, aby produkovaly dostatek protonové hybné síly pro zpětný chod části elektronového transportního řetězce, což vytváří NADH.
Koenzym NAD+ se také konzumuje v ADP-ribosylaci. Například enzymy zvané ADP-ribosyltransferázy přidávají ADP-ribosovou část této molekuly k proteinům v posttranslační modifikaci zvané ADP-ribosylace. Tato reakce zahrnuje buď přidání jediné ADP-ribosové skupiny v mono-ADP-ribosylaci, nebo přenos ADP-ribosylázy k proteinům v dlouhých rozvětvených řetězcích, který se nazývá poly(ADP-ribosyl)ace. Mono-ADP-ribosylace byla nejprve identifikována jako mechanismus skupiny bakteriálních toxinů, zejména cholera toxinu, ale podílí se také na normální buněčné signalizaci. Poly(ADP-ribosyl)ace se provádí poly(ADP-ribosovými) polymerázami. Poly(ADP-ribosová) struktura se podílí na regulaci několika buněčných dějů a je nejdůležitější v buněčném jádru, v procesech jako je oprava DNA a údržba telomer. Kromě těchto funkcí v buňce byla nedávno objevena skupina extracelulárních ADP-ribosyltransferáz, ale jejich funkce zůstávají nejasné.
Struktura cyklického ADP-ribózy.
Další funkcí tohoto koenzymu v buněčné signalizaci je jako prekurzor cyklické ADP-ribózy, která se vyrábí z NAD+ pomocí ADP-ribosylcykláz, jako součást druhého messengerového systému. Tato molekula působí v signalizaci vápníku uvolněním vápníku z intracelulárních zásob. Toho dosahuje vazbou a otevřením třídy vápníkových kanálů zvaných ryanodinové receptory, které jsou umístěny v membránách organel, jako je endoplazmatické retikulum.
NAD+ je také konzumován sirtuiny, což jsou deacetylázy závislé na NAD, jako je Sir2. Tyto enzymy působí tak, že přenášejí acetylovou skupinu ze svého substrátového proteinu do ADP-ribózové části NAD+; tím štěpí koenzym a uvolňuje nikotinamid a O-acetyl-ADP-ribózu. Zdá se, že sirtuiny se podílejí především na regulaci transkripce deacetylací histonů a změnou struktury nukleozomů. I když ne-histonové proteiny mohou být deacetylovány také sirtuiny. Tyto aktivity sirtuinů jsou zajímavé zejména díky jejich významu v regulaci stárnutí.
Mezi další enzymy závislé na NAD patří bakteriální DNA ligázy, které spojují dva konce DNA pomocí NAD+ jako substrátu a darují adenosinmonofosfátovou skupinu (AMP) 5′ fosfátu jednoho konce DNA. Tento meziprodukt je pak napaden 3′ hydroxylovou skupinou druhého konce DNA a vytváří novou fosfodiesterovou vazbu. To kontrastuje s eukaryotickými DNA ligázami, které používají ATP k vytvoření meziproduktu DNA-AMP.
Enzymy, které tvoří a používají NAD+ a NADH, jsou důležité jak v současné farmakologii, tak ve výzkumu budoucí léčby nemocí. Návrh léčiv a jejich vývoj využívá NAD+ třemi způsoby: jako přímý cíl léčiv, navrhováním inhibitorů enzymů nebo aktivátorů založených na jejich struktuře, které mění aktivitu enzymů závislých na NAD, a snahou inhibovat biosyntézu NAD+.
Koenzym NAD+ se sám o sobě v současné době nepoužívá jako léčba jakéhokoli onemocnění. Potenciálně je však užitečný při léčbě neurodegenerativních onemocnění, jako je Alzheimerova a Parkinsonova choroba. Důkazy o použití NAD+ při neurodegeneraci jsou smíšené; studie na myších jsou slibné, zatímco placebem kontrolovaná klinická studie žádný účinek neprokázala. NAD+ je také přímým cílem léku isoniazidu, který se používá při léčbě tuberkulózy, infekce způsobené Mycobacterium tuberculosis. Isoniazid je proléčivo a jakmile se dostane do bakterie, aktivuje se peroxidázou, která oxiduje sloučeninu do formy volných radikálů. Tento radikál pak reaguje s NADH a vytváří addukty, které jsou velmi silnými inhibitory enzymů enoyl-acyl, nosné protein reduktázy a dihydrofolát reduktázy.
Vzhledem k tomu, že velké množství oxidoreduktáz používá NAD+ a NADH jako substráty a váže je pomocí vysoce konzervovaného strukturálního motivu, je překvapivá představa, že inhibitory založené na NAD+ by mohly být specifické pro jeden enzym. To však může být možné: například inhibitory založené na sloučeninách kyselina mykofenolová a tiazofurin inhibují IMP dehydrogenázu na vazebném místě NAD+. Vzhledem k důležitosti tohoto enzymu v metabolismu purinů mohou být tyto sloučeniny užitečné jako protinádorové, antivirové nebo imunosupresivní léky. Jiné léky nejsou inhibitory enzymů, ale místo toho aktivují enzymy podílející se na metabolismu NAD+. Sirtuiny jsou pro takové léky zvláště zajímavým cílem, protože aktivace těchto NAD-závislých deacetyláz prodlužuje životnost. Sloučeniny jako resveratrol zvyšují aktivitu těchto enzymů, což může být důležité pro jejich schopnost oddálit stárnutí jak u obratlovců, tak u bezobratlých modelových organismů.
Vzhledem k rozdílům v metabolických drahách biosyntézy NAD+ mezi organismy, například mezi bakteriemi a lidmi, je tato oblast metabolismu slibnou oblastí pro vývoj nových antibiotik. Například enzym nikotinamidáza, který přeměňuje nikotinamid na kyselinu nikotinovou, je cílem pro návrh léčiv, protože tento enzym u lidí chybí, ale je přítomen v kvasinkách a bakteriích.
Arthur Harden, spoluobjevitel NAD.
Koenzym NAD+ byl poprvé objeven britskými biochemiky Arthurem Hardenem a Williamem Youndinem v roce 1906. Všimli si, že přidáním vařeného a filtrovaného kvasnicového extraktu se značně urychlila alkoholová fermentace v nerozmaštěných kvasnicových extraktech. Neidentifikovaný faktor zodpovědný za tento efekt nazvali coferment. Díky dlouhému a obtížnému čištění kvasnicových extraktů byl tento tepelně stabilní faktor Hansem von Euler-Chelpinem identifikován jako nukleotidový fosfát cukru. V roce 1936 ukázal německý vědec Otto Heinrich Warburg funkci nukleotidového koenzymu při přenosu hydridu a identifikoval nikotinamidovou část jako místo redoxních reakcí.
Nedredoxní role NAD(P) jsou nedávným objevem. První z těchto funkcí, které byly identifikovány, bylo použití NAD+ jako dárce ADP-ribózy při ADP-ribosylačních reakcích, pozorované počátkem 60. let.[84] Pozdější studie v 80. a 90. letech odhalily aktivity NAD+ a NADP+ metabolitů v buněčné signalizaci – například působení cyklického ADP-ribózy, které bylo objeveno v roce 1987.[85] Metabolismus NAD+ zůstal oblastí intenzivního výzkumu do 21. století, přičemž zájem se zvýšil po objevení proteinových deacetyláz závislých na NAD+, zvaných sirtuiny, v roce 2000, Shinichiro Imai a spolupracovníci z Massachusettského technologického institutu.[86]