Androgen je obecný termín pro jakoukoli přírodní nebo syntetickou sloučeninu, obvykle steroidní hormon, který stimuluje nebo řídí vývoj a udržování mužských charakteristik u obratlovců tím, že se váže na androgenní receptory. Patří sem činnost doplňkových mužských pohlavních orgánů a vývoj mužských sekundárních pohlavních charakteristik. Androgeny, které byly poprvé objeveny v roce 1936, se také nazývají androgenní hormony nebo testoidy. Androgeny jsou také původní anabolické steroidy. Jsou také prekurzorem všech estrogenů, ženských pohlavních hormonů. Primárním a nejznámějším androgenem je testosteron.
Vliv androgenů na neshodu pohlaví v dětství
Plody jsou vystaveny prenatálním androgenům již v 8. týdnu vývoje. Mužské plody jsou vystaveny mnohem vyšším hladinám androgenů než plody ženské. Bylo zjištěno, že preference hraček, kamarádi na hraní a styly hry se liší podle toho, jak je dítě vystaveno androgenům. Bez ohledu na biologické pohlaví dítěte je zvýšená expozice androgenům spojena s chováním spíše mužského typu, zatímco snížená expozice androgenům je spojena s chováním více ženského typu.
Podskupina androgenů, nadledvinových androgenů, zahrnuje některý z 19uhlíkových steroidů syntetizovaných kůrou nadledvin, vnější částí nadledviny, které fungují jako slabé steroidy nebo prekurzory steroidů, včetně dehydroepiandrosteronu (DHEA), dehydroepiandrosteron sulfátu (DHEA-S) a androstenedionu.
Během vývoje savců jsou pohlavní žlázy zpočátku schopné stát se buď vaječníky, nebo varlaty. U lidí jsou gonadální rudimenty přítomny přibližně od 4. týdne v mezistupni mezodermu, který sousedí s vyvíjejícími se ledvinami. Zhruba v 6. týdnu se epiteliální pohlavní pupečníky vyvíjejí v rámci tvořících se varlat a začleňují zárodečné buňky, jak migrují do pohlavních žláz. U mužů určité geny chromozomu Y, zejména SRY, kontrolují vývoj mužského fenotypu, včetně přeměny časného potenciálu bigonády na varlata. U mužů pohlavní pupečníky plně napadají vyvíjející se pohlavní žlázy.
Epiteliální buňky pohlavních šňůr odvozené od mezodermu se ve vyvíjejících se varlatech stávají Sertoliho buňkami, které budou fungovat na podporu tvorby spermií. Menší populace neeteliálních buněk se objeví mezi tubuly do 8. týdne vývoje lidského plodu. Jedná se o Leydigovy buňky. Brzy poté, co se diferencují, začnou Leydigovy buňky produkovat androgeny.
Androgeny fungují jako parakrinní hormony, které Sertoliho buňky potřebují pro podporu tvorby spermií. Jsou také potřebné pro maskulinizaci vyvíjejícího se mužského plodu (včetně tvorby penisu a šourku). Pod vlivem androgenů se zbytky mesonephronu, Wolffianových kanálků, vyvíjejí do nadvarlete, chámovodů a semenných váčků. Tento účinek androgenů je podporován hormonem ze Sertoliho buněk, Müllerianovým inhibičním hormonem (MIH), který zabraňuje embryonálním Müllerianovým kanálkům, aby se vyvinuly do vejcovodů a dalších tkání ženského reprodukčního ústrojí u mužských embryí. MIH a androgeny spolupracují, aby umožnily normální pohyb varlat do šourku.
Před tvorbou hypofyzárního hormonu luteinizačního hormonu (LH) embryem, která začíná přibližně v 11.-12. týdnu, podporuje lidský choriový gonadotropin (hCG) diferenciaci Leydigových buněk a jejich produkci androgenů v 8. týdnu. Androgenní působení v cílových tkáních často zahrnuje konverzi testosteronu na 5α-dihydrotestosteron (DHT).
Během puberty vzrůstá produkce androgenů, LH a FSH a pohlavní vaziva jsou dutá, vytvářejí semenotvorné tubuly a zárodečné buňky se začnou diferencovat na spermie. V průběhu dospělosti androgeny a FSH spolupracují na Sertoliho buňkách ve varlatech, aby podpořily produkci spermií. Exogenní androgenní doplňky mohou být používány jako mužská antikoncepce. Zvýšené hladiny androgenů způsobené užíváním androgenních doplňků mohou inhibovat produkci LH a blokovat produkci endogenních androgenů Leydigovými buňkami. Bez lokálně vysokých hladin androgenů ve varlatech v důsledku produkce androgenů Leydigovými buňkami mohou semenotvorné tubuly degenerovat, což vede k neplodnosti.
Inhibice ukládání tuku
Muži mají obvykle méně tělesného tuku než ženy. Nedávné výsledky naznačují, že androgeny inhibují schopnost některých tukových buněk ukládat lipidy tím, že blokují signální transdukční dráhu, která normálně podporuje funkci adipocytů. Také androgeny, ale ne estrogeny, zvyšují beta-adrenergní receptory a zároveň snižují alfa-adrenergní receptory – což má za následek zvýšené hladiny epinefrinu/norepinefrinu v důsledku nedostatku negativní zpětné vazby na alfa-2 receptory a snížené hromadění tuku v důsledku působení epinefrinu/norepinefrinu pak na beta receptory indukující lipolýzu.
Samci mají obvykle větší objem kosterního svalstva než samice. Androgeny podporují zvětšování buněk kosterního svalstva a pravděpodobně působí koordinovaně na posílení svalové funkce působením na několik typů buněk ve tkáni kosterního svalstva.
Cirkulující hladiny androgenů mohou ovlivňovat lidské chování, protože některé neurony jsou citlivé na steroidní hormony. Hladiny androgenů byly zapleteny do regulace lidské agrese a libida. Androgeny jsou skutečně schopné měnit strukturu mozku u několika druhů, včetně myší, krys a primátů, což vede k rozdílům v pohlaví. Četné zprávy ukázaly, že androgeny samotné jsou schopné měnit strukturu mozku, ale identifikace toho, které změny v neuroanatomii pramení z androgenů nebo estrogenů je obtížná, kvůli jejich potenciálu konverze.
Screeningové metody pro androgeny
Metody pro celá zvířata (In Vivo)
Neporušená zvířata používaná k měření androgenní aktivity (Allen a Doisy, 1924; Hershberger a kol., 1953).
Metody in vivo
– Využijte vrozeného hormonálně řízeného vývoje tkáně a udržovacích reakcí zvířete a
– Použijte tyto reakce k určení, zda podávané látky mění normální reakci.
Je třeba odstranit vrozenou schopnost zvířete produkovat tyto hormony.
(M. Chaturvedia, P.C. Mali, A.S. Ansarib; Farmakologie: 2003; 68:38-48)
Histoarchitektura varlat
Bioanalýza – vyhodnocení gonadální odezvy na látku měřením produkce steroidního hormonu a jeho uvolňování po podání testovacích ponorek.
Neporušené dospělé zvíře je vystaveno GnRH nebo látce podobné LH nebo FSH, která stimuluje hormonální odezvu.
Sériové vzorky krve odebrané a změřené za účelem vyhodnocení, zda testovaná látka způsobuje zvýšení testosteronu
Použité techniky zahrnují odběr vzorků ocasní žíly, ošetření ocasní žíly a/nebo katetrizaci krční žíly (Fail et al., 1995; Fail and Anderson, 2002).
Byla použita řada různých cílových parametrů.
Metoda kombinace celého zvířete a izolovaných orgánů (ex vivo)
odebraných vzorků a izolovaných varlat.
Metody izolovaných orgánů (in vitro)
Vyvinuto pro králíka Vandemarkem a Ewingem (1963), upraveno pro krysu Chubbem a Ewingem (1979).
Jednoduchá technika inkubace celých orgánů
Screening AR aktivity pomocí genových expresních testů
· KB2 assay (Vickie S. Wilson; 2002: Toxicological Sciences 66, 69-81)
· Popište účinky androgenů ve stabilně transformované buněčné linii, kterou vyvinuly (MDA-KB2), která vyjadřuje lidskou AR (hAR) a promotor reagující na AR spojený s reportérským genem luciferázy (MMTV-luc).
· Hlavní výhoda KB2 assay — využívá geneticky modifikovanou buněčnou linii, která eliminuje námahu a vrozenou variabilitu spojenou s opakovanými přechodnými transfekcemi.
· Buněčná linie karcinomu prsu, MDA-MB-453, byla stabilně transformována s genovým konstruktem MMTV.luciferase.neo reporter.
· Protože GR i AR jsou přítomny v buňkách MDA-MB-453 a oba receptory mohou působit prostřednictvím promotoru MMTV, sloučeniny, které působí prostřednictvím AR nebo GR, aktivují reportéra luciferázy MMTV.
· Agonisté AR jako dihydrotestosteron (DHT) a agonisté GR jako dexamethason (DEX), kortikosteron a aldosteron indukují expresi luciferázy ve vhodných koncentracích.
· DHT konzistentně produkoval 3-9násobnou indukci v koncentracích od 0,1 do 10 nM.
· K odlišení AR- od GR-zprostředkovaných ligandů byly chemické látky analyzovány souběžně s antiandrogenem, hydroxyflutamidem (OHF), který blokuje AR- ale ne GR-zprostředkované reakce.
· Tyto buňky jsou relativně snadno kultivovatelné a udržovatelné.
· Responsiveness byla sledována v průběhu času a byla stabilní pro více než 80 pasáží.
· Některé výhody — relativně rychlé (2 dny), eliminuje potřebu transfekce, lze provádět v 96-jamkovém formátu destiček, přináší konzistentní reprodukovatelné výsledky
K transformaci byly použity buňky MDA-MB-453 (ATCC č. HTB 131).
Buňky byly osazeny dávkou 2 x 105 buněk na 60mm kultivační misku v udržovacím médiu, poté byly transformovány pomocí Fugene 6 (Roche) podle protokolu výrobce, s 5 µg pMMTV.luc.neo na jednu misku.
K prověření citlivosti klonů na agonistu androgenu byly buňky vypěstované z jednotlivých kolonií pokoveny dávkou 1 x 104 buněk na jamku v 96jamkových luminometrických deskách, které se nechaly připojit. Po připojení buněk bylo médium nahrazeno čerstvě připraveným dávkovacím médiem obsahujícím pouze ethanol (negativní kontrola), agonistu (dihydrotestosteron, DHT; 1 nM), nebo agonistu plus známého konkurenta (hydroxyflutamid, OHF; 1 M).
Buňky byly dávkovány 100 µl média/jamky a inkubovány 20–24 h, –sklizeny s
25 µl lytického pufru na jamku a vyšetřeny na aktivitu reporteru luciferázy.
– Po připojení buněk (4-6 h) bylo médium odstraněno a nahrazeno dávkovacím médiem. Zásobní roztoky pro každou chemickou látku byly připraveny v 1000x v ethanolu.
– Dávkovací médium bylo připraveno v době ošetření poměrným přepočtem 1 µl zásobního roztoku do 1 ml udržovacího média
-Kontrolní vrty vozidla obsahovaly 100 µl média/dobře s 1 µl ethanolu/ml média. Každá destička také obsahovala buď 0,1 nebo 1,0 nM DHT, nebo DHT/plus 1 µM OHF jako agonistickou kontrolu.
-Buňky byly inkubovány přes noc při 37°C bez CO2.
– Relativní světelné jednotky byly převedeny na ohybovou indukci nad kontrolní hodnotou vozidla pro každou repliku pro statistickou analýzu.
-Stabilita androgenní odpovědi a výchozí aktivity Aktivita luciferázy indukovaná androgenní indukcí měřená po dobu přibližně 9 měsíců kontinuální kultury pro vyhodnocení stability a reaktivity klonu MDA-kb2.
-buňky byly testovány ve více než 80 pasážích na jejich odpověď na 1 nM DHT.
-V prvních pasážích byla indukce luciferázy v porovnání s kontrolami rozpouštědla asi 10násobná.
-V kontinuální kultuře, luciferáza indukce klesla v průběhu času, ale reaktivita stabilizoval na 30 až 40 pasáží.
-V pozdějších pasážích byla minimálně 5–6násobná indukce v odpovědi na 1 nM DHT soustavně udržována po zbývající testovací období pro více než 80 pasáží, což prokazuje stabilní expresi genu luciferázy.
P. C. Hartig,1, Toxicological Sciences 66, 82-90 (2002)
(L. G. Parks; Toxikologické vědy 62, 257-267 (2001)
COS celobuněčné stanovení vazby lidského androgenního receptoru (hAR)
(0,13 M ethylhexadecyldimethylammonium bromidu s 3% ledové kyseliny octové).
· 1 µM hydroxyflutamidu bylo přidáno do poloviny vzorků, aby se zjistilo, zda tento silný antiandrogen bude blokovat aktivitu luciferázy vyvolanou zkoušenou látkou.
· Buňky byly také vystaveny 1 nM DHT jako pozitivní kontrola.
CV-1 AR a GR 40-dependentní transkripční aktivační testy
· Dvacet čtyři hodin po transfekci bylo médium nasátováno a nahrazeno 2 ml média obsahujícího zkoušenou látku.
· Buňky pak inkubovány při 37 °C pod 5% oxidem uhličitým.
· Po 5 hodinách expozice bylo médium odstraněno a buňky byly jednou omyty fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem a sklizeny s 500 µl lytického pufru.
· Relativní světelné jednotky 0,05 ml alikvotních podílů lyzátu stanovené pomocí luminometru Monolight 2010.
Imunocytochemie COS buněk
Experiment provedený za účelem vizualizace, pomocí imunofluorescence, ligandem indukované nukleární translokace hAR v COS buňkách.
·Dvě komorová sklíčka byla osazena 100 000 buňkami/komora ve 2 ml DMEM doplněna 10% FBS
·Buňky byly transfekovány 0,5 µg pCMVhAR
·Po transfekci bylo do sklíček přidáno 2 ml média obsahujícího zkoušenou látku, inkubováno po dobu 24 hodin při 37 °C pod 5% CO2.
·Druhý den byly buňky po odstranění média jednou omyty DPBS (Dulbeccovým fosfátovým pufrovaným fyziologickým roztokem), nechány oschnout po dobu 45 minut při pokojové teplotě, fixovány po dobu 10 minut 95% etanolem (-20 °C), blokovány 5% BSA a inkubovány přes noc primární protilátkou AR (1:1000) při 4 °C.
·Následující den byly buňky jednou omyty DPBS a inkubovány fluorescenčně značenou sekundární protilátkou po dobu 30 minut při pokojové teplotě.
·Pro vizualizaci jader byly buňky kontrabarveny DAPI, barvou DNA, osazeny fluoromountovými sklíčky vyšetřenými pomocí mikroskopu při 200 násobném zvětšení.
·Lokalizace AR byla klasifikována jako perinukleární nebo nukleární zaslepeně z 10 náhodně vybraných polí ze sklíčka pro každé místo.
·V jiném experimentu byly buňky vystaveny 1 nM DHT, jako pozitivní kontrola.
Nový systém biologické zkoušky kvasinek pro detekci androgenních sloučenin.
Lee HJ, Lee YS, Kwon HB, Lee K.;Toxicol In Vitro. :2003 Apr;17(2):237-44.
Zpráva o vývoji rychlého, jednoduchého, účinného systému detekce kvasinek pro androgenní sloučeniny, založeného na interakci kvasinkových dvou-hybridních proteinů.
Necitlivost k androgenům u lidí
Snížená schopnost plodu s karyotypem XY reagovat na androgeny může mít za následek jeden z několika problémů, včetně neplodnosti a několika forem intersexuálních onemocnění. Viz syndrom necitlivosti androgenů (AIS).
Poznámka: Anabolické steroidy, včetně těch, které jsou pouze slabě virilizující (nebo dokonce anti-virilizující (např., oxandrolon)), jsou zde zahrnuty (protože jejich anabolické účinky jsou nicméně zprostředkovány aktivací androgenního receptoru).
Poznámka: Inhibitory 21-hydroxylázy mohou také ovlivňovat hladiny androgenů, protože brání metabolismu prekurzorů androgenních steroidů.