Závislost na kokainu zahrnuje epigenetickou modifikaci genů v mozku.
Role inhibitorů HDAC v závislosti na kokainu
Inhibitory histondeacetylázy (inhibitory HDAC) jsou považovány za potenciální léčbu závislých na kokainu. HDAC jsou enzymy, které mohou deacetylovat histony spojené s geny. To může aktivovat geny pro transkripci. Několik experimentů ukázalo, že inhibice HDAC zapojených do deacetylace H3K9 snižuje chování při vyhledávání drog.
Je známo, že epigenetické regulace, jako je metylace H3K9, mají klíčovou roli v mechanismu závislosti. Nedávné studie ukázaly, že podávání inhibitorů HDAC může pomoci snížit touhu po kokainu u potkanů. Specifickými inhibitory HDAC spojenými se sníženým chováním hledajícím kokain jsou trichostatin A a fenylbutyrát. Trichostatin A (TsA) inhibuje HDAC třídy 1, 3, 4, 6 a 10. Fenylbutyrát (PhB) inhibuje HDAC třídu 1. Vzhledem k tomu, že tyto inhibitory HDAC mají tak významný vliv na chování hledající kokain, vědci spekulují o jejich schopnosti snížit riziko relapsu u závislého na kokainu v modelovém systému potkanů během rehabilitace.
Po několika testech, ve kterých byli potkani vystaveni kokainu následovanému buď inhibitorem HDAC nebo placebem, bylo zjištěno, že inhibitory HDAC mají významný vliv na snížení chování při vyhledávání kokainu. To také naznačuje epigenetický mechanismus podílející se na regulaci chromatinu HDAC. Údaje jsou klíčové pro prokázání hypotézy, že trichostatin A a fenylbutyrát mohou přetvořit strukturu chromatinu a zabránit změnám chování po expozici kokainu. Testy také odhalily, že podávání inhibitorů HDAC může nejen zabránit závislosti, ale také pomáhá snížit riziko relapsu u závislých na kokainu v systému modelů potkanů.
Jak naznačují předchozí zjištění, chronické užívání kokainu způsobilo jak změny v remodelační aktivitě HDAC, tak i v chování při vyhledávání drog. Renthal a kol. se zaměřili konkrétně na histondeacetylázu HDAC5 třídy II, protože bylo známo, že má regulaci závislou na aktivitě v neuronech. Ve skutečnosti zjistili, že HDAC5 je ústředním regulátorem působení chronického užívání kokainu a svou deacetylázovou aktivitou přispívá k adaptaci chování. Chronické kokainové injekce zvýšily fosforylaci HDAC5 při Ser259 v Nucleus accumbens (NAc) během 30 minut. To poskytuje místa pro spojení 14-3-3 proteinů, které zprostředkovávají vývoz HDAC5 z jádra. Zjistili také, že CaMKII je nezbytný pro depolarizací indukovanou fosforylaci HDAC5 v NAc tkáni, což zdůrazňuje jeho roli kinázy pro HDAC5. Experimenty s mutovanými proteiny a inhibitory HDAC naznačily, že působení HDAC5 je zprostředkováno prostřednictvím jeho katalytické domény deacetylázy histonu. Rychlá fosforylace a vývoz HDAC5 z jádra po užívání kokainu s největší pravděpodobností vede ke zvýšeným „pulsům“ acetylace, cílené aktivaci genů a behaviorálním adaptacím na dlouhodobou expozici kokainu.
Druhý soubor experimentů, které Renthal a kol. provedli, ukázal, že chronické užívání kokainu indukovalo upregulaci proteinu NK1 receptoru u knokautovaných myší HDAC5, která je spojena s hyperacetylací H3 na promotoru NK1R genu. Promotor NK1R genu je spojován se zvýšenou reakcí na odměnu za kokain, což znamená, že HDAC5 v normálních genomech může snížit odměnu za kokain chronickou expozicí kokainu. Našli také klíčové cesty, které byly zapojeny do neuronové plasticity a chování odměny, které zahrnovaly signalizaci DA receptoru, ATF2/CREB signalizaci, NF-B, NFAT, cytoskeletální remodelační proteiny a iontové kanály. Jejich data implikovala remodelaci chromatinu jako mechanismus, který řídí pozměněnou aktivaci genů a behaviorální reakce na kokain. Pomocí toho byli schopni dojít k závěru, že v normálních genomech (divokého typu) zahrnuje reakce na chronický kokain fosforylaci HDAC5 a vývoz deacetylázy z jádra za účelem aktivace následných cílových genů. Mezi expozicí a 24 hodinami po ní se HDAC5 vrací do buněčného jádra, aby omezil expresi těchto kokainem regulovaných genů histonovou deacetylací. Jejich experimenty s HDAC5 knockoutujícími myšmi tuto hypotézu dodatečně podpořily. Protože HDAC5 zde není proto, aby omezoval expresi genu, začíná se hromadit s opakovanou expozicí kokainu, přičemž konečným výsledkem je zvýšená citlivost na odměnu za kokain.
Změny v kritických modifikacích H3K9me3
Modifikace histonů, jako jsou metylace a acetylace, mohou změnit vzorce genové exprese aktivací nebo deaktivací oblasti DNA pro transkripci. Pozice H3K9 byla prokázána několika studiemi, že je změněna chronickým užíváním kokainu.
Návykové chování pozorované u dlouhodobých uživatelů kokainu může být způsobeno změnami profilů genové exprese v mozkových odměnových obvodech. Většina výzkumů byla zaměřena na aktivní oblasti odměnových genů, ale Maze a spol. se zaměřují na to, co se děje s heterochromatickými oblastmi. Maze a spol. ukázali, že heterochromatické oblasti v nucleus accumbens (NAc), hlavní odměnový obvod v mozku, jsou významně změněny v pozici H3K9me3. Akutní expozice kokainu vede k rychlému nárůstu H3K9me3 během půl hodiny a snižuje se zpět na normální úroveň během 24 hodin. Chronická expozice kokainu vede k pomalejšímu nárůstu H3K9me3 během hodiny (i když v této době dosahuje stejné úrovně jako akutní) a k 50% poklesu oproti normálním výchozím hodnotám během 24 hodin. Tato chronická expozice byla navržena ke snížení heterochromatizace (destabilizace) v této oblasti mozku u pacientů po opakované expozici kokainu, což znamená, že dlouhodobé návykové chování je ovlivněno tímto epigenetickým znakem. Použili ChIP-seq k poskytnutí podpůrného důkazu, že modifikace H3K9me3 je lokalizována hlavně do intergenních oblastí. V těchto oblastech genomu mělo 17 oblastí opakovaných prvků (SINEs, LINEs, LTR, atd.) významné změny stavu H3K9me3 v modelech myší při chronické expozici kokainu. Použili qPCR k určení, že z těchto významných prvků vykázala oblast LINE-1 významné zvýšení úrovně exprese. LINE-1 je retrotranspozon, takže jeho nevhodná exprese může aktivovat transpozon, aby se sám vložil do důležitých genů a destabilizoval DNA. Svá zjištění uzavírají domněnkou, že vložení retrotranspozonu LINE-1 způsobuje nevhodnou nebo narušenou expresi genů vedoucí k návykovému chování.
Role G9a ve změnách modifikace H3K9me2
Podobně jako Maze a kol., studie Covingtona a kol. se zaměřily na modifikaci histonu v nucleus accumbens. Naznačují, že modifikace H3K9me2 v této oblasti mozku hraje roli v dráze stresu a deprese. Jejich myšlenkou bylo, že kokain modifikuje toto epigenetické znamení a že to zvyšuje zranitelnost závislého vůči stresu a depresi, což vede k návykovým účinkům těchto činidel. Bylo zjištěno, že methyltransferáza, G9a, má sníženou expresi v nucleus accumbens u závislých na kokainu, a proto způsobuje sníženou hladinu H3K9me2. Geny, které jsou necilencovány prostřednictvím acetylace heterochromatinu abnormálně exprimují geny zapojené do signalizační dráhy BDNF-TrkB-CREB. To způsobuje zvýšenou fosforylaci CREB po proudu dráhy. CREB způsobuje zvýšenou acetylaci a disregulaci signálních drah stresu a deprese.
Kokain vyvolává epigenetické změny, které vedou k morfologii neuronů a změnám chování. Většina změn souvisí s narušením heterochromatinu způsobeným sníženou hladinou metylace na histonech, konkrétně na H3K9. Tento pokles je zprostředkován potlačením G9a, lysindimethyltransferázy, která je regulována ∆FosB. ∆FosB je kokainem indukovaný transkripční faktor, který se hromadí v nucleus accumbens (NAc) a působí na potlačení G9a. Když je ∆FosB nadměrně exprimován, hladiny G9a jsou sníženy a hladiny dimethylace H3K9 jsou sníženy v NAc. Maze a kol. se zajímali o zjištění, jak snížené hladiny ovlivňují chování uživatelů kokainu. Bylo provedeno několik studií na potkanech a byl učiněn závěr, že nadměrná exprese G9a, a tedy přítomnost dimethylace H3K9, způsobuje sníženou preferenci kokainu u potkanů. Výzkumníci se poté zaměřili na jaderný objem potkanů vystavených kokainu a zjistili, že snížená regulace G9a zvyšuje množství dendritických páteří v nucleus accumbens, což vede ke zvýšenému chování při vyhledávání kokainu.
Je třeba poznamenat, že pouze v nucleus accumbens mají hladiny G9a význam pro závislost na kokainu. Byly provedeny studie, ve kterých byly hladiny G9a a hladiny H3K9me2 změněny v jiných oblastech mozku, ale tato jiná místa neměla žádný vliv na chování potkanů hledajících kokain.
Studie genové exprese v mezolimbickém systému
Bylo také prokázáno, že role deacetyláz sirtuinu hraje roli při zprostředkování závislosti na kokainu. Aby bylo možné určit jejich roli, musely být nejprve analyzovány dva výše zmíněné transkripční faktory ∆FosB a CREB. Již dříve bylo uvedeno, že ∆FosB zvyšuje chování uživatelů vyhledávajících kokain. Je to proto, že ∆FosB má jedinečně stabilní strukturu, která mu umožňuje přetrvávat a hromadit se v těle. Na rozdíl od ∆FosB je CREB zodpovědný za snížení citlivosti na kokain, který způsobuje negativní symptomy během ochranné periody. Každý z těchto transkripčních faktorů zvyšuje chování závislých hledajících kokain. Jakmile byla tato souvislost mezi transkripčními faktory prokázána, výzkumníci byli zvědaví, zda i jiné geny způsobují návykové chování a zkoumali ty, které jsou významnými markery závislosti na kokainu, jedním z nich byla skupina genů sirtuinu. Sirtuiny jsou deacetylázy histonu závislé na NAD třídy III. Sirtuiny nejen deacetylují histony, ale jsou také zodpovědné za deacetylaci tubulinu, p53 a NFKB. Několik studií zkoumalo roli sirtuinů v chování hledajícím kokain. V jednom souboru experimentů bylo zjištěno, že významný nárůst ∆FosB v nucleus accumbens vedl k ∆FosB vazbě na promotor SIRT2. Tato zvýšená vazba způsobila acetylaci H3, která je spojena se zvýšenou Sir2 mRNA. Bylo také zjištěno, že acetylace H3 vyvolaná kokainem zvýšila Sirt1 v nucleus accumbens. Opakované užívání kokainu tak způsobuje zvýšení Sirt1 i Sirt2. Vědci se pak zajímali o zjištění, jak zvýšený Sirt1 a Sirt2 ovlivnil jaderný objem, protože bylo již dříve prokázáno, že opakované užívání kokainu tak činí. Vědci studující Sirt1 a Sirt2 také zjistili, že tyto transkripční faktory vedly ke zvýšení jaderného objemu. Proto byl učiněn závěr, že ∆FosB, CREB, Sirt1 a Sirt2 hrají nedílnou roli v chování usilujícím o kokain.
Kumar a kol. se zaměřili na to, jak akutní a chronická expozice kokainu ovlivňuje striatum, což je další oblast mozku, která se podílí na odměně a pohybových drahách. Pro studium molekulárního působení kokainu v této oblasti zkoumali výzkumníci modifikace histonu tří různých promotorů: cFos, BDNF a Cdk5. Viděli, že cFos, který se normálně exprimuje bezprostředně poté, co neurony vypálí akční potenciály, má vysokou hladinu H4 acetylace během 30 minut po kokainové injekci – ale při chronickém užívání kokainu nebyly pozorovány žádné modifikace histonu. Tyto výsledky naznačily, že tento promotor je aktivován akutním užíváním kokainu a možná znamená, že neurony, které reguluje oheň rychle během akutní expozice kokainu, nejsou ovlivněny dlouhodobým užíváním. BDNF je zapleten jako kritický regulátor drogové závislosti a Cdk5 je zapleten do regulace genů buněčné proliferace. Oba tyto promotory byly indukovány chronickým užíváním kokainu (hyperacetylace H3). Změna přirozených acetylačních stavů těchto promotorů u akutních a chronických uživatelů kokainu změnila pohybové a odměnové reakce na kokain. To naznačuje, že behaviorální aktivita pozorovaná uživateli kokainu může být částečně přičítána úpravám histonu na těchto promotorových místech.
McClung a kol. rozebírají profily genové exprese dříve zmíněných CREB a ∆FosB, jak se podílejí na užívání kokainu. Bylo prokázáno, že tyto transkripční faktory hrají roli v krátkodobých a dlouhodobých adaptivních změnách v mozku. CREB se podílí na učení, paměti a depresi a obohacuje uživatele kokainu v rámci nucleus accumbens. Zdá se, že CREB vyvíjí mnoho genů ve své dráze v oblastech odměny v mozku a zdá se, že snižuje prospěšné účinky kokainu a vede místo toho k depresivnímu chování. Změny genové exprese pomocí CREB jsou vyvolány krátkodobou léčbou kokainem a nakonec se vracejí do normálu. Zaměřili se také na ∆FosB, který je v rodině FosB proteinů. Zatímco většina těchto proteinů se podílela na krátkodobých změnách genové exprese zneužívání, McClung a kol. prokázali, že ∆změny genové exprese FosB v NAc byly vyvolány krátkodobou a dlouhodobou expozicí kokainu. Krátkodobá expozice kokainu vedla ke stejným profilům exprese upregulovaných genů jako CREB vytvářející pozorované snížené odměňující účinky. Dlouhodobá expozice však vedla k odlišnému profilu exprese, což vedlo ke zvýšeným odměňujícím účinkům. Naznačili, že ∆FosB působí jako represor a nějakým způsobem interaguje s CREB dráhou a nepřímo vede ke stejným krátkodobým účinkům, jaké byly pozorovány, ale v průběhu času působí na upregulaci genů v rámci své vlastní dráhy, což vede ke zvýšeným odměňujícím účinkům. Není známo, jak tyto dvě dráhy interagují, ale ukázaly, že dochází k určitému překrývání.
Modifikace genové exprese drah dopaminových receptorů
Na proteinových drahách CREB-Fos se podílí také dopaminový D1 receptor (DA D1), který je exprimován v neuronech v oblastech nucleus accumbens a caudate putamen. Zhang a kol. se zaměřili na tento receptor, neboť je známo, že zprostředkovává účinky kokainu. Při stimulaci zvyšuje hladinu cAMP, což následně vede k aktivaci CREB. Pozorovali, že předchozí kokainové injekce vedly k přímému zvýšení citlivosti D1 receptoru. Prostřednictvím linií myší s mutací D1 receptoru byl také zapojen do zprostředkování jak lokomotorového vnímání, tak odměňujících účinků kokainu. Akutní kokainové injekce indukovaly expresi c-fos a CREB prostřednictvím D1 receptorů a opakované podávání kokainu, což souviselo s dlouhodobými transkripčními komplexy AP-1 obsahujícími ∆FosB. Perzistentní exprese ∆FosB v D1 receptorech v nucleus accumbens vedla k významnému zvýšení lokomotorových stimulujících a odměňujících účinků kokainu. Naopak bylo prokázáno, že zvýšení CREB snižuje odměňující účinky kokainu.
Zhang a kol. také používali mikročipy k identifikaci specifických genů indukovaných chronickým užíváním kokainu, které jsou závislé na funkčním D1 receptoru 24 hodin po vysazení kokainu. Bylo identifikováno 109 genů, které byly buď nahoře nebo dole regulovány 1,2krát nebo více u myší s mutací na D1 receptoru caudate putamen po opakovaných injekcích. Exprese těchto genů byla naprosto normální u myší s funkčními D1 receptory, což naznačuje, že chronické užívání kokainu mělo přímý vliv na zprostředkování těchto genů prostřednictvím funkčního DA D1 receptoru Našli geny patřící do řady funkčních skupin a vybrali si šest kandidátních genů ze tří z těchto funkčních skupin, aby ověřili jejich diferenciální expresi v caudate putamen. U každého genu vědci ověřili závislost jejich exprese na D1 receptoru po léčbě kokainem pomocí Trichostatinu A nebo jiných antagonistů receptorů. Konkrétně se zaměřili na geny kódující extracelulární faktory, receptory, modulátory a intracelulární signalizační molekuly. Ty mohou být regulovány chronickou léčbou kokainem prostřednictvím D1 receptorů a všechny geny obsahují AP-1 transkripční komplex vazebných míst v jejich promotorových oblastech. U extracelulárních signalizačních molekul se zaměřili na expresi genů IGFBP6 a SDF1. Oba tyto byly indukovány v caudatách putamen u divokých typů myší, ale atenuovány u mutantů D1 receptorů. To naznačuje, že IGFBP6 a SDF1 mohou být indukovány opakovaným podáváním kokainu a také, že tato interakce je částečně závislá na funkčním D1 receptoru.
Přímé změny funkčních skupin
Zhang a kol. již dříve viděli, že chronické podávání kokainu vede ke zvýšenému dendritickému větvení a hustotě páteře na středních neuronech páteře a prefrontálních kortexových pyramidových neuronech, což může přispívat k neuroadaptacím indukovaným kokainem. Při zkoumání genů, které byly receptory a modulátory, zjistili, že exprese sigma 1 receptoru a RGS4 nebyla po opakovaném podávání kokainu u mutantů DA D1 receptoru zvýšena, což naznačuje, že funkční dopaminový D1 receptor je nezbytný pro jejich indukci. Bylo zjištěno, že tento receptor moduluje prospěšné účinky kokainu a antagonisté receptorů zablokovali akutní lokomotorický stimulační účinek a snížili behaviorální senzibilizaci. Bylo prokázáno, že změny v sigma 1 receptoru modulují uvolňování dopaminu, takže posuny v jeho expresi mohou změnit behaviorální reakce na kokain s pre a postsynaptickými vlivy. Věděli, že proteiny RGS4 mohou modulovat funkci receptorů spřažených s G-proteinem, a protože hladiny RGS4 mohou zvýšit nebo snížit odezvu na stimulaci D1/D2 receptorů, mohlo by se to podílet na změnách signální transdukční dráhy po aktivaci D1 receptoru při opakované kokainové stimulaci.
U genů, které kódovaly intracelulární signální molekuly, se Zhang a kol. zaměřili na gen Wrch1. Po experimentu výzkumníci zjistili, že Wrch1 byl upregulován opakovanými kokainovými injekcemi v caudate putamen u mutantů receptoru D1. U divokých myší typu nedošlo k žádné změně, což je vedlo k domněnce, že Wrch1 může inhibovat kokainem indukované a D1 receptorem zprostředkované změny chování. Předpokládalo se, že klíčový člen signalizační dráhy Wnt, β-kateinin, byl indukován chronickým podáváním kokainu (což platilo v nucleus accumbens), ale akutní kokain snižoval expresi v caudate putamen, zatímco chronické kokainové injekce snižovaly expresi i v NAc u mutantů receptoru D1. Tato dráha ovlivňuje Wrch1, takže může ovlivňovat i kokainem indukované neuroadaptace. Nakonec zjistili, že CaMKII-α nebyl upregulován, jak se očekávalo, a CD2 byl u mutantů receptoru D1 po chronické léčbě snížen. Tyto výsledky naznačují, že změny genové exprese jsou rozhodně vyvolány chronickou expozicí kokainu prostřednictvím receptoru D1 a většinou na vazebných místech AP-1.
Změna kortikolimbického systému
Na rozdíl od většiny studií zaměřených na nucleus accumbens Febo a kol. naznačili, že obvody mozku odměny nejsou jediným systémem, který se podílí na návykovém chování. Předchozí poznatky naznačily, že stimulanty vyvolávají změny v genové expresi v hlavních částech mesolimbických obvodů (včetně ventrální tegmentální oblasti, ventrální striatum/nucleus accumbens a prefrontální kůry mozkové) a hrají velkou roli ve vývoji a udržování závislého stavu a remodelaci chromatinu. Tyto poznatky aplikovali při zkoumání, zda se tyto změny genové exprese podílejí na kokainových behaviorálních a molekulárních adaptacích. Zjistili neočekávané vzorce aktivace mozku u probuzených potkanů, kteří byli vystaveni butyrátu sodnému, inhibitoru HDAC (nebo HDACi). Akutní dávka vedla k rozsáhlé BOLD (v závislosti na hladině kyslíku v krvi) aktivaci v předním a středním mozku, ale kokainem indukovaná aktivace byla po opakované expozici významně zeslabena. Při souběžné léčbě butyrátem sodným s kokainem se po následných kokainových léčbách obnovila výrazná BOLD aktivace. Ty naznačují, že počáteční reakce mozku na opakovanou expozici kokainu spouští mechanismus desenzibilizace, který může být zvrácen předléčbou butyrátem sodným. Nervové obvody pro epigenetické modifikace přispívající k citlivosti kokainu nebyly omezeny na mezokortikolimbický dopaminový systém („systém odměny“), jak očekávali. Místo toho viděli, že kortikolimbické obvody (zapojené do emocí a paměti) mají větší roli ve změnách chování odměny souvisejících s HDACi. Důkazy, že zvýšení senzibilizujících účinků stimulantu zprostředkované HDACi je specifické pro kontext a zahrnuje asociativní učení.