Helmholtz byl synem ředitele Postupimského gymnázia Ferdinanda Helmholtze, který studoval klasickou filologii a filozofii a který byl blízkým přítelem nakladatele a filozofa Immanuela Hermanna Fichteho. Helmholtzova práce je ovlivněna filozofií Fichteho a Kanta. Snažil se vystopovat jejich teorie v empirických záležitostech, jako je fyziologie.
Jako mladý se Helmholtz zajímal o přírodní vědy, ale jeho otec chtěl, aby studoval medicínu na Charitě, protože tam byla finanční podpora pro studenty medicíny.
Helmholtzova napsal o mnoha tématech od stáří Země na původ sluneční soustavy.
Jeho první významný vědecký úspěch, fyzikální pojednání z roku 1847 o zachování energie, bylo napsáno v souvislosti s jeho lékařskými studiemi a filozofickým zázemím. Objevil princip zachování energie při studiu svalového metabolismu. Pokusil se prokázat, že žádná energie se neztrácí při pohybu svalů, motivován tím, že neexistují žádné životní síly nutné k pohybu svalu. To bylo odmítnutí spekulativní tradice Naturphilosophie, která byla v té době dominantním filozofickým paradigmatem v německé fyziologii.
Vycházeje z dřívější práce Sadiho Carnota, Émila Clapeyrona a Jamese Prescotta Jouleho, postuloval vztah mezi mechanikou, teplem, světlem, elektřinou a magnetismem tím, že je všechny pojímal jako projevy jediné síly (energie v moderních termínech). Své teorie publikoval ve své knize Über die Erhaltung der Kraft (O zachování síly, 1847).
Helmholtz je považován za prvního člověka, který předložil myšlenku tepelné smrti vesmíru v roce 1854.
Smyslová fyziologie Helmholtze byla základem práce Wilhelma Wundta, studenta Helmholtze, který je považován za jednoho ze zakladatelů experimentální psychologie. On, explicitněji než Helmholtz, popsal svůj výzkum jako formu empirické filozofie a jako studium mysli jako něčeho odděleného. Helmholtz ve svém raném vyvrácení spekulativní tradice Naturphilosophie z počátku devatenáctého století zdůraznil význam materialismu a zaměřil se více na jednotu „mysli“ a těla.
V roce 1851 způsobil Helmholtz převrat v oblasti oftalmologie vynálezem oftalmoskopu; nástroje používaného ke zkoumání vnitřku lidského oka. Helmholtzovy zájmy byly v té době stále více zaměřeny na fyziologii smyslů. Jeho hlavní publikace s názvem Handbuch der Physiologischen Optik (Příručka fyziologické optiky) poskytla empirické teorie o prostorovém vidění, barevném vidění a vnímání pohybu a stala se základním referenčním dílem v jeho oboru během druhé poloviny devatenáctého století. Jeho teorie o ubytování zůstala nezpochybněna až do poslední dekády 20. století.
Helmholtz před Humboldtovou univerzitou v Berlíně
Helmholtz pokračoval v práci po několik desetiletí na několika vydáních příručky, často aktualizoval svou práci kvůli svému sporu s Ewaldem Heringem, který zastával opačné názory na prostorové a barevné vidění. Tento spor rozdělil disciplínu fyziologie během druhé poloviny roku 1800.
V roce 1863 vydal Helmholtz knihu nazvanou O smyslech tónu jako fyziologickém základu pro teorii hudby, v níž opět demonstroval svůj zájem o fyziku vnímání. Tato kniha ovlivnila muzikology do dvacátého století. Helmholtz vynalezl Helmholtzův rezonátor, aby ukázal výšku různých tónů.
V roce 1871 se Helmholtz přestěhoval z Bonnu do Berlína, aby se stal profesorem fyziky. Začal se zajímat o elektromagnetismus.
Oliver Heaviside prohlásil, že existují podélné vlny v Helmholtzově teorii. I když neměl zásadní příspěvky k této oblasti, jeho student Heinrich Rudolf Hertz se stal slavným jako první, kdo prokáže elektromagnetické záření. Helmholtz měl předpovědět E-M záření z Maxwellovy rovnice, a vlnová rovnice nyní nese jeho jméno. Velké německé sdružení výzkumných institucí, Helmholtzova asociace, je pojmenován po něm.
Dalšími studenty a výzkumnými spolupracovníky Helmholtze v Berlíně byli Max Planck, Heinrich Kayser, Eugen Goldstein, Wilhelm Wien, Arthur König, Henry Augustus Rowland, A. A. Michelson a Michael Pupin. Leo Koenigsberger, který studoval v Berlíně, zatímco Helmholtz tam byl, napsal definitivní životopis o něm v roce 1902.