Rekombinantní DNA

„Rekombinantní DNA (rDNA) je forma DNA, která neexistuje přirozeně a která se vytváří spojením sekvencí DNA, které by se normálně nevyskytovaly společně. Pokud jde o genetické modifikace, rekombinantní DNA se zavádí přidáním příslušné DNA do existující organismální DNA, jako jsou plasmidy bakterií, za účelem kódování nebo změny různých znaků pro určitý účel, jako je rezistence vůči antibiotikům. Od genetické rekombinace se liší tím, že neprobíhá procesy uvnitř buňky, ale je uměle vytvořena. Rekombinantní protein je protein, který je odvozen z rekombinantní DNA.

Techniku rekombinantní DNA poprvé navrhl Peter Lobban, postgraduální student, spolu s A. Dalem Kaiserem na Stanfordově univerzitě na katedře biochemie. Techniku pak realizovali Lobban a Kaiser; Jackson, Symons a Berg; a Stanley Norman Cohen, Chang, Herbert Boyer a Helling, v letech 1972-74. Své poznatky publikovali v dokumentech včetně práce z roku 1972 „Biochemická metoda pro vkládání nových genetických informací do DNA Simianova viru 40: Cirkulární SV40 DNA Molekuly obsahující Lambda Phage Genes a Galactose Operon of Escherichia coli“, práce z roku 1973 „Enzymatické end-to-end spojování molekul DNA“ a práce z roku 1974 „Konstrukce biologicky funkčních bakteriálních plazmidů in vitro“, které všechny popisovaly techniky pro izolaci a amplifikaci genů nebo úseků DNA a jejich vložení do jiné buňky s přesností, čímž vznikla transgenní bakterie. Technologie rekombinantní DNA byla umožněna objevem, izolací a aplikací restriktivních endonukleáz Wernerem Arberem, Danielem Nathansem a Hamiltonem Smithem, za což obdrželi v roce 1978 Nobelovu cenu za medicínu. Cohen a Boyer požádali o patent na proces výroby biologicky funkčních molekulárních chimér, které nemohly v přírodě v roce 1974 existovat. Patent byl udělen v roce 1980.

Klonování a vztah k plazmidům

Jednoduchý příklad, jak je požadovaný gen vložen do plazmidu. V tomto příkladu se gen specifikovaný v bílé barvě stává nepoužitelným, když je přidán nový gen.

Doporučujeme:  Asonie

Použití klonování souvisí s rekombinantní DNA v klasické biologii, neboť termín „klon“ označuje buňku nebo organismus odvozený z rodičovského organismu, přičemž moderní biologie označuje tento termín jako soubor buněk odvozených ze stejné buňky, které zůstávají identické. V klasickém případě poskytuje použití rekombinantní DNA počáteční buňku, ze které se pak očekává rekapitulace hostitelského organismu, když podstoupí další buněčné dělení, přičemž bakterie zůstávají hlavním příkladem díky použití virových vektorů v medicíně, které obsahují rekombinantní DNA vloženou do struktury známé jako plazmid.

Plasmidy jsou extrachromozomální samoreplikující se kruhové formy DNA přítomné ve většině bakterií, jako je Escherichia coli (E. Coli), obsahující geny související s katabolismem a metabolickou aktivitou a umožňující přenašečské bakterii přežít a rozmnožovat se v podmínkách přítomných v jiných druzích a prostředích. Tyto geny představují charakteristiky odolnosti vůči bakteriofágům a antibiotikům a některým těžkým kovům, ale mohou být také poměrně snadno odstraněny nebo odděleny od plazmidu restrikčními endonukleázami, které pravidelně vytvářejí „lepivé konce“ a umožňují navázání vybraného segmentu DNA, který kóduje více „reparativních“ látek, jako jsou léky na peptidové hormony včetně inzulínu, růstového hormonu a oxytocinu. Při zavádění užitečných genů do plazmidu se pak bakterie používají jako virový vektor, který je povzbuzován k reprodukci, aby zrekapituloval změněnou DNA v jiných buňkách, které infikuje, a zvýšil množství buněk s rekombinantní DNA přítomnou v nich.

Použití plazmidů je také klíčové v rámci genové terapie, kde jsou jejich příbuzné viry používány jako klonovací vektory nebo nosiče, které jsou prostředkem transportu a přenosu genů v rekombinantní DNA prostřednictvím rozmnožování virů v celém organismu. Plasmidy obsahují tři společné rysy – replikátor, selektivní marker a klonovací místo. Replikátor nebo „ori“ odkazuje na původ replikace s ohledem na místo a bakterie, kde začíná replikace. Marker odkazuje na konkrétní gen, který obvykle obsahuje rezistenci na antibiotikum, ale může také odkazovat na gen, který je připojen vedle požadovaného, například ten, který propůjčuje luminiscenci umožňující identifikaci úspěšně rekombinované DNA. Klonovací místo je sekvence nukleotidů představující jednu nebo více pozic, kde dochází k štěpení restrikcí endonukleáz. Většina eukaryot neudržuje kanonické plazmidy; významnou výjimkou jsou kvasinky. Kromě toho lze Ti plazmid bakterie Agrobacterium tumefaciens použít k integraci cizí DNA do genomů mnoha rostlin. Mezi další metody zavádění nebo vytváření rekombinantní DNA u eukaryot patří homologní rekombinace a transfekce s modifikovanými viry.

Doporučujeme:  Dvoustranný převod

Příklad vzniku chimérického plazmidu ze dvou „tupých konců“ prostřednictvím enzymu T4 ligázy.

Když je pak rekombinantní DNA dále pozměněna nebo změněna na hostitele dalších řetězců DNA, vzniklá molekula je označována jako „chimérická“ molekula DNA s odkazem na mytologickou chiméru, která se skládala z několika zvířat. Přítomnost molekul chimérického plazmidu je poněkud pravidelná, protože po celou dobu života organismu zajišťuje šíření vektory přítomnost statisíců organismálních a bakteriálních buněk, které všechny obsahují kopie původní chimérické DNA.

Při výrobě chimérických plazmidů mohou být příslušné procesy poněkud nejisté, protože zamýšleného výsledku přidání cizí DNA nemusí být vždy dosaženo a může dojít ke vzniku nepoužitelných plazmidů. Zpočátku je struktura plazmidu linearizována, aby se umožnilo přidání vazbou komplementárních cizích řetězců DNA na jednovláknové „převisy“ nebo „lepivé konce“ přítomné na koncích molekuly DNA z rozložených, nebo „S-tvarovaných“ štěpení vzniklých restrikčními endonukleázami.

Běžným vektorem používaným pro darování plazmidů byla původně bakterie Escherichia coli a později derivát EcoRI, který se používal pro svou všestrannost s přidáním nové DNA „uvolněnou“ replikací, když byl inhibován chloramfenikolem a spektinomycinem, později byl nahrazen plazmidem pBR322.V případě EcoRI se plazmid může žíhat s přítomností cizí DNA cestou ligace s lepkavým koncem, nebo s „tupými konci“ pomocí ligace s tupým koncem, za přítomnosti fágové T4 ligázy, která vytváří kovalentní vazby mezi 3-uhlíkovými OH a 5-uhlíkovými PO4 skupinami přítomnými na tupých koncích. Mezi cizími DNA segmenty se může objevit jak ligatura s lepkavým koncem, nebo převislá ligace a ligace s tupým koncem, tak rozštěpené konce původního plazmidu v závislosti na restrikční endonukleáze používané pro rozštěpení.

Výroba syntetického inzulínu za použití rekombinantní DNA

Specifická genová sekvence neboli oligonukleotid, která kóduje produkci inzulínu u lidí, byla zavedena do vzorkové kolonie E. coli (bakterie nacházející se v lidském střevě). Sekvenci zachytí jen asi 1 ze 106 bakterií. Protože však životní cyklus je u E. coli jen asi 30 minut, není toto omezení problematické a za 24 hodin mohou být miliardy E. coli, které jsou kódovány sekvencemi DNA potřebnými k navození produkce inzulínu.

Doporučujeme:  Faktorový experiment

Odběr vzorků prvotní reakce však ukázal, že Humulin byl přivítán spíše jako technologický než medicínský průlom a že tento sentiment rostl ještě předtím, než se lék dostal do lékáren.

The Economist dospěl k závěru: „Z prvního léku vyrobeného brouky pro lidské použití se může vyklubat komerční propadák. Ale biotechnologům se zajímavými novými produkty se nyní uvolnila cesta – a to pozoruhodně rychle – k tomu, aby překonali regulační překážky a utekli s cenami.“

K široké adopci biosyntetického „lidského“ inzulínu spotřebiteli nakonec nedošlo, dokud výrobci neodstranili z trhu vysoce čištěný zvířecí inzulín.