Narodil se ve Spokane ve státě Washington a studoval na Princetonské univerzitě, než získal Rhodesovo stipendium na Oxfordské univerzitě, kde studoval neuropatologii pod vedením sira Charlese Scotta Sherringtona. Lékařský titul získal na Univerzitě Johnse Hopkinse. Několik let studoval v Oxfordu (kde znal Williama Oslera) a ve Španělsku, Německu a New Yorku.
Penfield byl průkopnický výzkumník a vysoce originální chirurg. Se svým kolegou Herbertem Jasperem léčil pacienty se závažnou epilepsií tím, že ničil nervové buňky v mozku, kde záchvaty vznikly. Před operací stimuloval mozek elektrickými sondami, zatímco pacienti byli při vědomí na operačním stole (pouze v lokální anestezii), a sledoval jejich reakce. Tímto způsobem mohl přesněji zaměřit oblasti mozku, které jsou za to zodpovědné, a snížit tak vedlejší účinky operace.
Tato technika mu také umožnila vytvořit mapy smyslové a motorické kůry mozku ukazující jejich spojení s různými končetinami a orgány těla. Tyto mapy se používají dodnes, prakticky nezměněné. Spolu s Herbertem Jasperem publikoval tuto práci v roce 1951 (2. vyd., 1954) jako mezník epilepsie a funkční anatomie lidského mozku. Tato práce přispěla velkou měrou k pochopení lateralizace mozkových funkcí.
Zjistil také, že stimulace spánkových laloků může vést k živému vyvolání vzpomínek. Jeho vývoj neurochirurgické techniky, která způsobila méně zraňující meningo-cerebrální jizvu, se stal široce přijímaným v oblasti neurochirurgie, kde je „Penfieldův pitomec“ stále v každodenním používání.
Během svého života byl nazýván „největším žijícím Kanaďanem“. Věnoval mnoho přemýšlení funkcím mysli a až do své smrti se zamýšlel nad tím, zda existuje nějaký vědecký základ pro existenci lidské duše.
Po absolvování chirurgického učiliště pod vedením Harveyho Cushinga získal místo v Neurologickém institutu v New Yorku, kde prováděl své první samostatné operace proti epilepsii. Během pobytu v New Yorku se setkal s Davidem Rockefellerem, který toužil po založení institutu, kde by Penfield mohl studovat chirurgickou léčbu epilepsie. Akademická politika mezi newyorskými neurology však zabránila založení tohoto institutu v New Yorku; následně se Penfield v roce 1928 přestěhoval do Montrealu. Tam Penfield učil na McGillově univerzitě a v Královské nemocnici ve Victorii a stal se prvním neurochirurgem ve městě. V roce 1934 se stal prvním ředitelem Montrealského neurologického institutu McGillovy univerzity a přidružené Montrealské neurologické nemocnice, kterou pomáhal založit s financováním Rockefellerovy nadace. V roce 1960 odešel do důchodu a začal se věnovat psaní, produkoval román a také svou autobiografii No Man Alone.
V roce 1967 mu byl udělen Řád Kanady. V roce 1994 byl uveden do Kanadské lékařské síně slávy.
Avenue Docteur-Penfield na svahu Mount Royal v Montrealu byla na Penfieldovu počest pojmenována 5. října 1978. Část této třídy sousedí s McGillovým kampusem.
Epilepsie a funkční anatomie lidského mozku. 2. vydání. Jasper, H., and Penfield, W. Little, Brown and Co., 1954. ISBN 0316698334
The Torch. Penfield, W. Little, Brown and Co.; 1960. ISBN 1140758779. „Příběh o lásce, zradě a boji za pravdu ve starověkém Řecku.“