Staining je biochemická technika, při níž se do substrátu přidává barvivo specifické pro danou třídu (DNA, proteiny, lipidy, sacharidy), aby se kvantifikovala nebo kvantifikovala přítomnost určité sloučeniny. Je podobná fluorescenčnímu tagování.
Skvrny a barviva se často používají v biologii a medicíně ke zvýraznění struktur v biologických tkáních pro prohlížení, často za pomoci různých mikroskopů. Skvrny mohou být použity k definování a zkoumání objemových tkání (zvýraznění například svalových vláken nebo pojivové tkáně), buněčných populací (klasifikace různých krvinek, například) nebo organel v rámci jednotlivých buněk.
Biologické barvení se také používá k označení buněk v průtokové cytometrii a k označení bílkovin nebo nukleových kyselin v gelové elektroforéze.
Mikroskop a obarvené sklíčko.
In vitro barvení zahrnuje barvení buněk nebo struktur, které již nežijí. In vitro znamená doslova „ve skle“; porovnejte s in vivo. Některé skvrny jsou často kombinovány, aby odhalily více detailů a rysů než jen jedno barvení samotné. V kombinaci se specifickými protokoly pro fixaci a přípravu vzorku mohou vědci a lékaři tyto standardní techniky používat jako konzistentní, opakovatelné diagnostické nástroje. Protisvětlo je barvení přidané tak, aby viditelné buňky nebo struktury nebyly obarveny hlavním barvením. Například krystalově fialové barvení pouze grampozitivními bakteriemi při Gramově barvení. Aplikuje se safraninové protibarvení, které obarví všechny buňky, což umožňuje také identifikaci gramnegativních bakterií.
Přípravné kroky závisí na typu plánované analýzy; mohou být požadovány některé nebo všechny následující postupy.
Permeabilizace zahrnuje léčbu buněk (obvykle) mírnou povrchově aktivní látkou. Tato léčba rozpustí buněčné membrány a umožní přístup větších molekul barviva do vnitřku buňky.
Fixace, která se sama může skládat z několika kroků, si klade za cíl co nejvíce zachovat tvar buněk nebo tkáně, kterých se to týká. Většina fixativ (chemikálií způsobujících fixaci) vytváří chemické vazby mezi bílkovinami a dalšími látkami ve vzorku, což zvyšuje jejich tuhost. Běžné fixativní roztoky často zahrnují formaldehyd, etanol, metanol a/nebo kyselinu pikrovou. Kusy tkáně mohou být vloženy do parafínového vosku, aby se zvýšila jejich mechanická pevnost a stabilita a aby se snáze krájely na tenké plátky.
Montáž obvykle spočívá v připevnění vzorků na sklíčko skleněného mikroskopu za účelem pozorování a analýzy. V některých případech mohou být buňky vypěstovány přímo na sklíčku. U vzorků volných buněk (jako u krevního nátěru nebo pap nátěru) může být vzorek přímo aplikován na sklíčko. U větších kusů tkáně jsou tenké řezy (plátky) vyrobeny pomocí mikrotomu; tyto plátky pak mohou být připevněny a zkontrolovány.
V nejjednodušším případě může vlastní proces barvení spočívat v ponoření vzorku (před nebo po fixaci a namontování) do roztoku barviva a následném opláchnutí a pozorování.
Mnoho barviv však vyžaduje použití mořidla: chemické sloučeniny, která reaguje s barvivem a vytváří nerozpustnou barevnou sraženinu. Když se přebytečný roztok barviva odplaví, mořidlo zůstane.
Gramovo barvení se používá k určení gramového statusu pro širokou klasifikaci bakterií. Je založeno na složení jejich buněčné stěny. Gramovo barvení používá krystalově fialovou barvu k barvení buněčných stěn, jod jako mořidlo a fuchsin nebo safranin k barvení všech bakterií. Gramovo barvení je v medicíně důležité; přítomnost nebo nepřítomnost buněčné stěny změní citlivost bakterie na některá antibiotika.
Grampozitivní bakterie barví tmavě modrou nebo fialovou barvou. Jejich buněčná stěna je typicky bohatá na peptidoglykan a postrádá sekundární membránu a lipopolysacharidovou vrstvu, která se vyskytuje u gramnegativních bakterií.
Na většině gramnegativních preparátů se gramnegativní organismy objeví červené nebo růžové, protože jsou protibarvené. Na rozdíl od většiny grampozitivních bakterií mají gramnegativní bakterie jen několik vrstev peptidoglykanu a sekundární buněčnou membránu tvořenou primárně lipopolysacharidem.
obarvení hematoxylinem a eosinem (H&E)
H&E obarvila plicní tkáň pacienta s rozedmou plic.
Protokol o barvení hematoxylinem a eosinem se v histologii často používá ke zkoumání tenkých částí tkáně. Hematoxylin barví buněčná jádra modře, zatímco eosin barví cytoplazmu a pojivovou tkáň růžově nebo červeně. Eosin je silně absorbován červenými krvinkami a zbarvuje je jasně červeně.
Papanicolaou barvení, nebo Pap barvení, je často používaná metoda pro zkoumání buněčných vzorků z různých tělesných sekretů. Často se používá k barvení Pap stěrů vzorků. Používá se kombinace hematoxylinu, Orange G, Eosin Y, světle zelená SF nažloutlá, a někdy Bismarck Brown Y.
Periodické Acid-Schiffovo barvení se používá k demonstraci sacharidů (glykogen, glykoprotein, proteoglykany). Používá se k rozlišení různých typů onemocnění ukládání glykogenu.
Massonův trichrom je (jak název napovídá) tříbarevný barvicí protokol. Recept se vyvinul z Massonovy původní techniky pro různé specifické aplikace, ale všechny jsou vhodné k odlišení buněk od okolní pojivové tkáně. Většina receptů produkuje červený keratin a svalová vlákna, modré nebo zelené barvení kolagenu a kostí, světle červené nebo růžové barvení cytoplazmy a jádra černých buněk.
Romanowského skvrny jsou všechny založeny na kombinaci eosinátu (chemicky redukovaného eosinu) a methylenové modři (někdy s jeho oxidačními produkty azurovou A a azurovou B). Běžné varianty zahrnují Wrightovu skvrnu, Jennerovu skvrnu, Leishmanovu skvrnu a Giemsovu skvrnu.
Všechny se používají k vyšetření vzorků krve nebo kostní dřeně. Při vyšetření krevních buněk jsou preferovány před H&E, protože lze snadno rozlišit různé typy leukocytů (bílých krvinek). Všechny jsou také vhodné k vyšetření krve k odhalení krví přenosných parazitů, jako je malárie.
Stříbrné barvení je použití stříbra k barvení histologických řezů. Tento druh barvení je důležitý zejména pro zobrazení proteinů (například kolagenu typu III) a DNA. Používá se k zobrazení látek uvnitř i vně buněk. Stříbrné barvení se používá také v teplotním gradientu gelové elektroforézy.
Některé buňky jsou argentaffin. Ty redukují stříbrný roztok na kovové stříbro po fixaci formalinem. Tuto metodu objevil Ital Camillo Golgi pomocí reakce mezi dusičnanem stříbrným a dichromanem draselným, čímž se v některých buňkách vysráží chroman stříbrný (viz Golgiho metoda). Jiné buňky jsou argyrofilní. Ty redukují stříbrný roztok na kovové stříbro po vystavení skvrně, která obsahuje redukční činidlo, například hydrochinon nebo formalin.
Súdánské barvení je použití súdánských barviv k barvení sudanofilních látek, obvykle lipidů. Súdán III, Súdán IV, Olej Red O a Súdán Black B jsou často používány. Súdánské barvení je často používán ke stanovení hladiny fekálního tuku k diagnostice steatorrhea.
In vivo barvení je proces barvení živých tkání – in vivo znamená „za života“ (srovnej s in vitro barvením). Tím, že určité buňky nebo struktury získávají kontrastní barvu (barvy), lze snadno vidět a studovat jejich formu (morfologii) nebo pozici uvnitř buňky nebo tkáně. Obvyklým účelem je odhalit cytologické detaily, které by jinak nemusely být patrné; barvení však může také odhalit, kde v buňkách nebo tkáních dochází k určitým chemickým látkám nebo specifickým chemickým reakcím.
Často se tyto skvrny nazývají vitální skvrny. Do organismu jsou zaváděny v době, kdy buňky ještě žijí. Tyto skvrny jsou však nakonec pro organismus toxické, některé více než jiné. Pro dosažení požadovaných účinků se skvrny používají ve velmi zředěných roztocích v rozmezí od 1:5 000 do 1:500 000 (Howey, 2000). Všimněte si, že mnoho skvrn může být použito jak v živých, tak v pevných buňkách.
Různé skvrny reagují nebo se koncentrují v různých částech buňky nebo tkáně a tyto vlastnosti se využívají ve prospěch odhalení konkrétních částí nebo oblastí. Některé z nejběžnějších biologických skvrn jsou uvedeny níže. Pokud není uvedeno jinak, všechna tato barviva mohou být použita s pevnými buňkami a tkáněmi; vitální barviva (vhodná pro použití s živými organismy) jsou zaznamenána.
Bismarckova hnědá (také Bismarckova hnědá Y nebo Manchesterova hnědá) dodává kyselým mucinům žlutou barvu. Bismarckova hnědá může být použita s živými buňkami.
Karmín je intenzivně červené barvivo, které může být použito k barvení glykogenu, zatímco karmínový hliník je nukleární barvivo. Karmínové skvrny vyžadují použití mořidla, obvykle hliníku.
Coomassie modrá (také zářivě modrá) nespecificky barví bílkoviny výraznou modrou barvou. Často se používá v gelové elektroforéze.
Křišťálově fialová barva v kombinaci s vhodným mořidlem zbarví buněčné stěny do fialova. Křišťálově fialová barva je důležitou složkou při Gramově barvení.
DAPI je fluorescenční nukleární skvrna, excitovaná ultrafialovým světlem a vykazující silnou modrou fluorescenci při vazbě na DNA. DAPI není viditelný při běžné transmisní mikroskopii. Může být použit v živých nebo neměnných buňkách.
Eosin se nejčastěji používá jako protibarvivo proti hematoxylinu, propůjčuje růžovou nebo červenou barvu cytoplazmatickému materiálu, buněčným membránám a některým extracelulárním strukturám. Dodává také červenou barvu červeným krvinkám. Eosin může být také použit jako protibarvivo v některých variantách Gramova barvení a v mnoha dalších protokolech. Existují vlastně dvě velmi blízce příbuzné sloučeniny běžně označované jako eosin. Nejčastěji používaný je eosin Y (také známý jako eosin Y ws nebo eosin yellowish); má velmi lehce nažloutlý nádech. Druhou sloučeninou eosinu je eosin B (eosin namodralý nebo imperial red); má velmi slabý namodralý nádech. Obě barviva jsou zaměnitelná a použití jednoho nebo druhého je spíše otázkou preference a tradice.
Ethidium-bromid intercaláty a barví DNA, čímž vytváří fluorescenční červeno-oranžové barvení. Ačkoli nebude barvit zdravé buňky, může být použit k identifikaci buněk, které jsou v závěrečném stádiu apoptózy – takové buňky mají mnohem propustnější membrány. V důsledku toho se ethidium-bromid často používá jako marker apoptózy u buněčných populací a k lokalizaci pásem DNA v gelové elektroforéze.
Fuchsin se může používat k barvení kolagenu, hladké svaloviny nebo mitochondrií.
Kyselina fuchsin se běžně používá v Massonově trichromu a van Giesonově picro-fuchsinu a používala se i ve starší metodě barvení mitochondrií.
Hematoxylin (hematoxylin v Severní Americe) je nukleární barvivo. Používá se s mořidlem, hematoxylin barví nukleové modrofialové nebo hnědé. Nejčastěji se používá s eosinem při barvení H&E (hematoxylin a eosin) – jeden z nejčastějších postupů v histologii.
Hoechst 33258 a Hoechst 33342 jsou dvě úzce příbuzné fluorescenční skvrny. Při vazbě na DNA silně fluoreskují, ale nejsou viditelné při přenosu světla. Obě sloučeniny jsou si funkčně velmi podobné a obě mohou být použity v živých buňkách.
Jód se používá v chemii jako indikátor škrobu. Když se škrob smíchá s jódem v roztoku, vytvoří se intenzivně tmavě modrá barva představující komplex škrob/jód. Škrob je látka společná většině rostlinných buněk, a proto slabý roztok jódu obarví škrob přítomný v buňkách. Jód je jednou ze složek barvicí techniky známé jako Gramovo barvení, používané v mikrobiologii.
Lugolův roztok nebo také Lugolův jód (IKI) je hnědý roztok, který v přítomnosti škrobů zčerná a může být použit jako buněčné barvivo, čímž se buněčná jádra více zviditelní.
Malachitová zeleň (také známá jako diamantová zeleň B nebo viktoriánská zeleň B) může být použita jako modrozelená barva proti safraninu v Gimenezově barvicí technice pro bakterie. Může být také použita k přímému barvení spor.
Methylová zeleň je chemicky příbuzná křišťálově fialové, která má navíc methylovou nebo ethylovou skupinu.
Methylenová modř se používá k barvení živočišných buněk, například lidských lícních buněk, aby byla jejich jádra lépe pozorovatelná.
Neutrální červená (nebo toluylenová červená) barví nukleovou červení. Obvykle se používá jako protibarvivo v kombinaci s jinými barvivy.
Nilová modř (nebo Nilová modř A) barví nukleovou modří. Může být používán s živými buňkami.
Nilová červeň (také známá jako nilská modř oxazonu) vzniká vařením nilské modři s kyselinou sírovou. Vzniká tak směs nilské červeně a nilské modři. Nilová červeň je lipofilní barva; hromadí se v lipidových globulích uvnitř buněk a barví je do červena. Nilová červeň může být použita s živými buňkami.
Tetroxid osmitý se používá v optické mikroskopii k barvení lipidů. Rozpouští se v tucích a organickými materiály se redukuje na elementární osmium, snadno viditelnou černou látku.
Rhodamin je proteinově specifické fluorescenční barvivo běžně používané ve fluorescenční mikroskopii.
Safranin (nebo Safranin O) je nukleární barvivo. Vytváří červená jádra a používá se především jako protibarvivo. Safranin může být také použit k dodání žluté barvy kolagenu.
Podobně jako u lehké mikroskopie mohou být skvrny použity k selektivnímu zvýraznění buněčných struktur v transmisní elektronové mikroskopii. Typicky se používají sloučeniny těžkých kovů s elektronovou hustotou. Například kyselina fosfocystická je běžným negativním barvivem virů, nervů, polysacharidů a dalších biologických tkáňových materiálů.
Mezi další chemické látky používané při barvení elektronovou mikroskopií patří molybdenan amonný, jodid kademnatý, karbohydrazid, chlorid železitý, hexamin, trichlorid inditý, dusičnan lanthanitý, octan olovnatý, citrát olovnatý, dusičnan olovnatý, tetroxid osmitý, kyselina periodická, kyselina fosfomolybidová, ferrikyanid draselný, ferrokyanid draselný, rutheniová červeň, dusičnan stříbrný, chloroaurat sodný, dusičnan thallitý, thiosemicarbazid, octan uranylnatý, dusičnan uranylnatý a vanadylsulfát.