Defosforylace je odstranění fosfátové skupiny (PO43-) z organické sloučeniny hydrolýzou. Jedná se o reverzibilní posttranslační modifikaci, která je spojena s přidáváním fosfátových skupin neboli fosforylací. Jedná se o vysoce regulovaný proces, při kterém defosforylace aktivuje a deaktivuje enzymy štěpením fosforečných esterů a anhydridů. Významným projevem defosforylace je přeměna ATP na ADP a anorganický fosfát.
Při defosforylaci se používá typ hydrolytického enzymu neboli hydrolázy, který štěpí esterové vazby. Významnou podtřídou hydroláz používanou při defosforylaci je fosfatáza. Fosfatáza odstraňuje fosfátové skupiny hydrolyzací monoesterů kyseliny fosforečné na fosfátový ion a molekulu s volnou hydroxylovou skupinou (-OH).
Reverzibilní reakce fosforylace-defosforylace probíhá v každém fyziologickém procesu, takže správná funkce proteinových fosfáz je nezbytná pro životaschopnost organismu. Protože defosforylace proteinů je klíčovým procesem zapojeným do buněčné signalizace, jsou proteinové fosfatázy zapojeny do stavů, jako jsou srdeční onemocnění, diabetes a Alzheimerova choroba.
K objevu defosforylace vedla série experimentů zkoumajících enzym fosforylázu izolovanou z králičího kosterního svalu. V roce 1955 Edwin Krebs a Edmond Fischer pomocí radioaktivně značeného ATP zjistili, že k serinovému zbytku fosforylázy se přidává fosfát, který ji fosforylací převádí z formy b na formu. Následně Krebs a Fischer ukázali, že tato fosforylace je součástí kinázové kaskády. Nakonec, po přečištění fosforylované formy enzymu, fosforylázy a, z králičích jater, byla použita iontově výměnná chromatografie k identifikaci fosfoproteinové fosfatázy I a II.
Od objevu těchto defosforylačních proteinů je reverzibilní povaha fosforylace a defosforylace spojena s širokou škálou funkčních proteinů, především enzymatických, ale také neenzymatických. Edwin Krebs a Edmond Fischer získali v roce 1992 Nobelovu cenu za fyziologii nebo medicínu za objev reverzibilní fosforylace proteinů.
Krystalografická struktura lidské fosfatázy a tenzinového homologu (PTEN). Aktivní místo modré N-koncové fosfatázové domény je znázorněno žlutě. C-koncová doména C2 je znázorněna červeně.
Fosforylace a defosforylace hydroxylových skupin neutrálních, ale polárních aminokyselin, jako jsou serin, treonin a tyrosin, v rámci specifických cílových proteinů je základní součástí regulace každého fyziologického procesu. Fosforylace zahrnuje kovalentní modifikaci hydroxylu fosfátovou skupinou prostřednictvím nukleofilního ataku alfa-fosfátu v ATP kyslíkem v hydroxylu. Defosforylace zahrnuje odstranění fosfátové skupiny hydratační reakcí přidáním molekuly vody a uvolněním původní fosfátové skupiny, čímž se regeneruje hydroxyl. Oba procesy jsou reverzibilní a oba mechanismy lze použít k aktivaci nebo deaktivaci proteinu. Fosforylace proteinu vyvolává mnoho biochemických účinků, například změnu jeho konformace, která mění jeho vazbu na specifický ligand a zvyšuje nebo snižuje jeho aktivitu. Fosforylaci a defosforylaci lze použít u všech typů substrátů, jako jsou strukturní proteiny, enzymy, membránové kanály, signální molekuly a jiné kinázy a fosfatázy. Souhrn těchto procesů se označuje jako fosforegulace. Deregulace fosforylace může vést k onemocnění.
Posttranslační modifikace
Při syntéze proteinů musí být polypeptidové řetězce, které vznikají při překladu mRNA ribozomy, zpracovány, než získají zralou konformaci. Defosforylace proteinů je mechanismus pro změnu chování proteinu, často aktivací nebo inaktivací enzymu. Součásti proteosyntetického aparátu také podléhají fosforylaci a defosforylaci, a tím regulují rychlost syntézy proteinů.
V rámci postranslačních modifikací mohou být ze serinu, treoninu nebo tyrozinu odstraněny fosfátové skupiny. Dráhy intracelulární transdukce signálu tak závisí na postupné fosforylaci a defosforylaci široké škály proteinů.
Adenosintrifosfát neboli ATP funguje ve všech živých organismech jako „měna“ volné energie. Při spontánní defosforylační reakci se uvolňuje 30,5 kJ/mol, který je využíván k pohonu buněčných reakcí. Celkově jsou nespontánní reakce spojené s defosforylací ATP spontánní díky záporné změně volné energie spojené reakce. To je důležité pro řízení oxidativní fosforylace. ATP je defosforylován na ADP a anorganický fosfát.
Na buněčné úrovni určuje defosforylace ATPáz tok iontů do buňky a z buňky. Inhibitory protonové pumpy jsou třídou léčiv, která působí přímo na ATPázy gastrointestinálního traktu.
Viz Úloha defosforylace v onemocnění
Defosforylace v jiných reakcích
Kromě ATP podléhají defosforylaci i další molekuly v rámci jiných biologických systémů. V důsledku defosforylace dochází u různých sloučenin k různým změnám volné energie.
Význam defosforylace ve fotosystému II
První bílkovinný komplex fotosyntézy závislý na světle se označuje jako fotosystém II. Tento komplex využívá enzym k zachycení fotonů světla, čímž poskytuje většímu procesu fotosyntézy všechny elektrony potřebné k výrobě ATP. Fotosystém II je obzvláště citlivý na teplotu a desfosforylace byla označena za hnací sílu plasticity při reakci na měnící se teplotu. Ke zrychlené defosforylaci proteinů ve fotosyntetických thylakoidních membránách dochází při zvýšených teplotách, což přímo ovlivňuje desfosforylaci klíčových proteinů v komplexu fotosystému II.
Úloha defosforylace při onemocnění
Nadměrná defosforylace membránových ATPáz a protonových pump v gastrointestinálním traktu vede k vyšší sekreci žíravých peptických kyselin. Ty mají za následek pálení žáhy a ezofagitidu. V kombinaci s infekcí Helicobacter pylori je peptická vředová choroba způsobena zvýšeným pH, které defosforylace vyvolává.
Protein tau spojený s mikrotubuly je abnormálně hyperfosforylovaný, pokud je izolován z mozku pacientů trpících Alzheimerovou chorobou. To je způsobeno poruchou defosforylačních mechanismů na specifických aminokyselinách proteinu tau. Defosforylace tau je katalyzována proteinfosfatázou-2A a fosfatázou-2B. Na abnormální fosforylaci tau u Alzheimerovy choroby se může podílet nedostatek nebo modifikace jednoho nebo obou proteinů.
Defosforylace je také spojena se srdečními chorobami, zejména se změnou interakcí aktinu a myozinu, které jsou klíčové pro zajištění základní síly srdečního tepu. Defosforylace je klíčovou součástí kinetiky myosinových cyklů, které přímo řídí interakce aktin-myosin. Pokud je proces defosforylace přerušen, je srdeční kontrakce závislá na vápníku narušena nebo zcela znemožněna.
Výzkum také naznačil, že modifikace defosforylace ovlivňují fyziologické procesy spojené s diabetem mellitem. Ukazuje se, že kinetika defosforylace substrátu inzulinového receptoru-1/2, Akt a ERK1/2, fosfoproteinů, se podílí na signalizaci inzulinového receptoru a modely in vitro ukazují, že změny kinetiky defosforylace ovlivňují upstram a downstream stimulaci inzulinem.
Inhibice protonové pumpy významně snižuje kyselost gastrointestinálního traktu a zmírňuje příznaky onemocnění souvisejících s překyselením. Výsledná změna pH snižuje přežívání bakterie H.pylori, která je hlavní příčinou vředové choroby. Jakmile inhibitor protonové pumpy tuto bakterii ve střevě vymýtí, zvrátí erozivní reflux.
Léčba srdečních onemocnění se zlepšila díky použití léků, které inhibují AMPK prostřednictvím defosforylace.
Při léčbě cukrovky jsou léky sulfonylurey schopny stimulovat defosforylaci glukózového transportéru GLUT4, čímž se snižuje inzulínová rezistence a zvyšuje a využití glukózy.