Robotická příprava vzorků MALDI hmotnostní spektrometrie na nosiči vzorku.
Proteomika je rozsáhlé studium proteinů, zejména jejich struktur a funkcí. Proteiny jsou životně důležitými částmi živých organismů, neboť jsou hlavními složkami fyziologických metabolických drah buněk. Termín „proteomika“ byl poprvé vytvořen v roce 1997, aby vytvořil analogii s genomikou, tedy studiem genů. Slovo „proteom“ je směsí „proteinu“ a „genomu“ a vymyslel ho Marc Wilkins v roce 1994, když pracoval na tomto konceptu jako doktorand. Proteom je celý komplement proteinů, včetně modifikací provedených na konkrétním souboru proteinů, produkovaných organismem nebo systémem. To se bude lišit v závislosti na čase a odlišných požadavcích, nebo stresech, kterým buňka nebo organismus podléhá.
Po genomice je proteomika často považována za další krok ve studiu biologických systémů. Je mnohem složitější než genomika hlavně proto, že zatímco genom organismu je víceméně konstantní, proteom se liší buňku od buňky a čas od času. Je to proto, že odlišné geny jsou vyjádřeny v odlišných typech buněk. To znamená, že je třeba určit i základní soubor proteinů, které jsou produkovány v buňce.
V minulosti se to provádělo analýzou mRNA, ale bylo zjištěno, že to nekoreluje s obsahem bílkovin. Nyní je známo, že mRNA není vždy přeložena do bílkoviny a množství bílkoviny vytvořené pro dané množství mRNA závisí na genu, ze kterého je přepsána, a na aktuálním fyziologickém stavu buňky. Proteomika potvrzuje přítomnost bílkoviny a poskytuje přímé měření přítomného množství.
Příklady posttranslačních modifikací
Důležitější však je, že každý konkrétní protein může projít širokou škálou změn, které budou mít zásadní vliv na jeho funkci. Například během buněčné signalizace může mnoho enzymů a strukturních proteinů projít fosforylací. Přidání fosfátu ke konkrétním aminokyselinám – nejčastěji serin a threonin zprostředkované serin/threonin kinázami, nebo vzácněji tyrosin zprostředkovaný tyrosin kinázami – způsobí, že se protein stane cílem pro vazbu nebo interakci s odlišnou sadou jiných proteinů, které rozpoznají fosforylovanou doménu.
Protože fosforylace proteinů je jednou z nejvíce studovaných modifikací proteinů, mnoho „proteomických“ snah je zaměřeno na stanovení množiny fosforylovaných proteinů v konkrétní buňce nebo tkáni za určitých okolností. To vědce upozorní na signální dráhy, které mohou být v takovém případě aktivní.
Ubiquitin je malá bílkovina, kterou mohou na určité proteinové substráty navázat enzymy nazývané E3 ubiquitinové ligázy. Určení, které bílkoviny jsou poly-ubiquitinované, může být užitečné pro pochopení toho, jak jsou proteinové dráhy regulovány. Jedná se tedy o další legitimní „proteomickou“ studii. Podobně, jakmile se určí, které substráty jsou ubiquitinované každou ligázou, bude užitečné určit soubor ligáz vyjádřených v konkrétním buněčném typu.
Výčet všech modifikací bílkovin, které by mohly být zkoumány v projektu „Proteomika“, by vyžadoval diskusi o většině biochemie; proto zde poslouží krátký výčet pro ilustraci složitosti problému. Kromě fosforylace a ubiquitinace mohou být bílkoviny podrobeny metylaci, acetylaci, glykosylaci, oxidaci, nitrosylaci atd. Některé bílkoviny procházejí VŠECHNY těmito modifikacemi, což pěkně ilustruje potenciální složitost, se kterou se člověk musí vypořádat při studiu struktury a funkce bílkovin.
Odlišné bílkoviny jsou vyráběny v odlišných prostředích
I když člověk studuje určitý typ buňky, může tato buňka vytvářet různé množiny bílkovin v různou dobu nebo za různých podmínek. Navíc, jak již bylo zmíněno, každá jedna bílkovina může projít širokou škálou posttranslačních modifikací.
Proto se studie „proteomiky“ může velmi rychle stát poměrně složitou, i když je předmět studie velmi omezený. V ambicióznějších prostředích, například když se hledá biomarker pro nádor – když je vědec zabývající se proteomikou povinen studovat sérové vzorky od více pacientů s rakovinou – je složitost, kterou je třeba se zabývat, stejně velká jako v jakémkoli moderním biologickém projektu.
Omezení genomické studie
Vědci se velmi zajímají o proteomiku, protože umožňuje mnohem lepší pochopení organismu než genomika. Za prvé, úroveň transkripce genu poskytuje pouze hrubý odhad úrovně jeho exprese do proteinu. MRNA produkovaná v hojném množství může být rychle degradována nebo neefektivně přeložena, což vede k malému množství proteinu. Za druhé, jak je uvedeno výše, mnoho proteinů zažívá posttranslační modifikace, které hluboce ovlivňují jejich činnost; například některé proteiny nejsou aktivní, dokud se nestanou fosforylovanými. Ke studiu posttranslačních modifikací se používají metody jako fosfoproteomika a glykoproteomika. Za třetí, mnoho transkriptů dává vzniknout více než jednomu proteinu, a to prostřednictvím alternativního sestřihu nebo alternativních posttranslačních modifikací. Za čtvrté, mnoho proteinů tvoří komplexy s jinými proteiny nebo molekulami RNA a fungují pouze v přítomnosti těchto jiných molekul. A konečně, rychlost degradace bílkovin hraje důležitou roli v obsahu bílkovin.
Metody studia proteinů
Stanovení proteinů, které jsou posttranslačně modifikovány
Jedním ze způsobů, jak lze určitou bílkovinu studovat, je vytvoření protilátky, která je specifická pro tuto modifikaci. Existují například protilátky, které rozpoznají určité bílkoviny pouze v případě, že jsou tyrosin-fosforylovány; existují také protilátky specifické pro jiné modifikace. Ty mohou být použity k určení souboru bílkovin, které prošly modifikací zájmu.
Pro úpravy cukru, jako je glykosylace bílkovin, byly objeveny určité lektiny, které vážou cukry. I ty mohou být použity.
Běžnější způsob, jak určit posttranslační modifikaci zájmu, je podrobit složitou směs bílkovin elektroforéze ve „dvourozměrech“, což jednoduše znamená, že bílkoviny jsou elektroforizovány nejprve v jednom směru a pak v jiném… to umožňuje malé rozdíly v bílkovině vizualizovat oddělením modifikované bílkoviny od její nemodifikované formy. Tato metodika je známá jako „dvourozměrná gelová elektroforéza“.
Nedávno byl vyvinut jiný přístup nazvaný PROTOMAP, který kombinuje SDS-PAGE s brokovnicovou proteomikou, aby umožnil detekci změn v gelové migraci, například těch, které jsou způsobeny proteolýzou nebo posttranslační modifikací.
Stanovení existence bílkovin v komplexních směsích
Klasicky se ve studiích biochemie a buněčné biologie používají protilátky proti konkrétním bílkovinám nebo proti jejich modifikovaným formám. Patří mezi nejběžnější nástroje, které dnes praktikující biologové používají.
Pro kvantitativnější stanovení množství bílkovin lze použít techniky jako ELISA.
Pro proteomické studium byly použity novější techniky jako Matrix asistovaná laserová desorpce/ionizace pro rychlé stanovení proteinů v konkrétních směsích.
Navázání protein-proteinových interakcí
Většina proteinů funguje ve spolupráci s jinými proteiny a jedním z cílů proteomiky je určit, které proteiny na sebe vzájemně působí. To je zvláště užitečné při určování potenciálních partnerů v buněčných signalizačních kaskádách.
K dispozici je několik metod pro sondování protein-proteinových interakcí. Tradiční metodou je kvasinková dvouhybridní analýza. Nové metody zahrnují proteinová mikropole, imunoafinitní chromatografii následovanou hmotnostní spektrometrií, dvojpolarizační interferometrii a experimentální metody jako fágové zobrazení a výpočetní metody.
Praktické aplikace proteomiky
Jedním z nejslibnějších pokroků, které vzešly ze studia lidských genů a proteinů, byla identifikace potenciálních nových léků pro léčbu nemocí. Ta se opírá o informace o genomech a proteomech pro identifikaci proteinů spojených s nemocí, které pak počítačový software může použít jako cíle pro nové léky. Pokud je například určitá bílkovina zapletena do nemoci, její 3D struktura poskytuje informace pro navržení léků, které by zasahovaly do působení bílkoviny. Molekula, která odpovídá aktivnímu místu enzymu, ale nemůže být enzymem uvolněna, enzym inaktivuje. To je základ nových nástrojů pro objevování léků, jejichž cílem je najít nové léky, které inaktivují proteiny podílející se na nemoci. Protože se zjišťují genetické rozdíly mezi jednotlivci, výzkumníci očekávají, že tyto techniky využijí k vývoji personalizovaných léků, které jsou pro jednotlivce účinnější.
Počítačová technika, která se pokouší přiřadit miliony malých molekul k trojrozměrné struktuře proteinu, se nazývá „screening virtuálního ligandu“. Počítač hodnotí kvalitu přiřazení k různým místům v proteinu s cílem buď zvýšit nebo vyřadit funkci proteinu v závislosti na jeho funkci v buňce. Dobrým příkladem toho je identifikace nových léků, které se zaměřují na HIV-1 proteázu a inaktivují ji. HIV-1 proteáza je enzym, který štěpí velmi velký HIV protein na menší, funkční proteiny. Virus bez tohoto enzymu nemůže přežít; proto je jedním z nejúčinnějších proteinových cílů pro zabíjení HIV.
Porozumění proteomu, struktuře a funkci každého proteinu a složitosti protein-proteinových interakcí bude rozhodující pro vývoj nejúčinnějších diagnostických technik a léčby nemocí v budoucnosti.
Zajímavým využitím proteomiky je využití specifických bílkovinných biomarkerů k diagnostice onemocnění. Řada technik umožňuje testovat bílkoviny produkované během určitého onemocnění, což pomáhá rychle diagnostikovat onemocnění. Techniky zahrnují western blot, imunohistochemické barvení, enzymatický imunosorbentový test (ELISA) nebo hmotnostní spektrometrii. Níže jsou uvedeny některé z nemocí, které mají charakteristické biomarkery, které mohou lékaři použít pro diagnostiku.
U Alzheimerovy choroby se zvýšením beta sekretázy vytváří amyloid/beta-protein, který způsobuje hromadění plaku v mozku pacienta, o kterém se předpokládá, že hraje roli při demenci.[citace nutná] Cílení na tento enzym snižuje amyloid/beta-protein, a tak zpomaluje progresi onemocnění. Postupem testování na zvýšení amyloidu/beta-proteinu je imunohistochemické barvení, při kterém se protilátky vážou na specifické antigeny nebo biologickou tkáň amyloidu/beta-proteinu.
Srdeční onemocnění se běžně hodnotí pomocí několika klíčových biomarkerů založených na proteinech. Standardní proteinové biomarkery pro CVD zahrnují interleukin-6, interleukin-8, sérový amyloid A protein, fibrinogen a troponiny. cTnI srdeční troponin I se zvyšuje v koncentraci během 3 až 12 hodin po počátečním srdečním zranění a lze ho nalézt zvýšené dny po akutním infarktu myokardu. Řada komerčních testů založených na protilátkách, stejně jako další metody se používají v nemocnicích jako primární testy pro akutní infarkt myokardu.