Metafázová buňka pozitivní na přeskupení bcr/abl pomocí FISH
Cytogenetika je obor genetiky, který se zabývá studiem struktury a funkce buňky, zejména chromozomů. Zahrnuje rutinní analýzu G-pásových chromozomů, další cytogenetické techniky bandingu, stejně jako molekulární cytogenetiku, jako je fluorescenční in situ hybridizace (FISH) a srovnávací genomová hybridizace (CGH).
Chromozomy byly poprvé pozorovány v rostlinných buňkách Karlem Wilhelmem von Nägelim v roce 1842. Jejich chování v živočišných (salamandrových) buňkách popsal Walther Flemming, objevitel mitózy, v roce 1882. Jméno vymyslel jiný německý anatom, von Waldeyer v roce 1888.
Další fáze nastala po vývoji genetiky na počátku 20. století, kdy bylo oceněno, že sada chromozomů (karyotyp) je nositelem genů. Zdá se, že Levickij byl první, kdo definoval karyotyp jako fenotypický vzhled somatických chromozomů, na rozdíl od jejich genního obsahu. Výzkum lidského karyotypu trval mnoho let, než se vyřešila nejzákladnější otázka: kolik chromozomů obsahuje normální diploidní lidská buňka? V roce 1912 Hans von Winiwarter nahlásil 47 chromozomů ve spermatogonii a 48 v oogonii, čímž uzavřel XX/XO mechanismus určování pohlaví. Malíř si v roce 1922 nebyl jistý, zda diploidní počet člověka je 46 nebo 48, zprvu upřednostňoval 46. Svůj názor později přehodnotil ze 46 na 48 a správně trval na tom, aby člověk měl XX/XY systém. Vzhledem k jejich technikám byly tyto výsledky docela pozoruhodné.
K definitivnímu vyřešení problému byly zapotřebí nové techniky:
Trvalo to až do poloviny 50. let, než se začalo všeobecně uznávat, že karyotyp člověka zahrnuje pouze 46 chromozomů. Zajímavé je, že lidoopi mají 48 chromozomů. Lidský chromozom 2 vznikl sloučením chromozomů předků, čímž se jejich počet snížil.
McClintockova práce o kukuřici
Barbara McClintocková zahájila svou kariéru jako cytogenetička kukuřice. V roce 1931 McClintocková a Harriet Creightonová prokázaly, že cytologická rekombinace značených chromozomů koreluje s rekombinací genetických znaků (genů). McClintocková pokračovala ve své kariéře v cytogenetice studiem mechaniky a dědičnosti chromozomů lámaných a kruhových (kruhových) z kukuřice. Během své cytogenetické práce McClintocková objevila transpozony, což nakonec vedlo k její Nobelově ceně v roce 1983.
Přirozené populace drozofily
Ve třicátých letech Dobzhansky a jeho spolupracovníci sbírali Drosophila pseudoobscura a D. persimilis z divokých populací v Kalifornii a sousedních státech. Pomocí Painterovy techniky studovali polytenové chromozomy a zjistili, že divoké populace jsou polymorfní pro chromozomální inverze. Všechny mouchy vypadají stejně bez ohledu na to, jakou inverzi nesou: toto je příklad kryptického polymorfismu.
Rychle se nashromáždily důkazy, které dokazovaly, že za to může přirozený výběr. Pomocí metody, kterou vymysleli L’Heretier a Teissier, Dobzhansky rozmnožoval populace v populačních klecích, což umožňovalo krmení, chov a odběr vzorků a zároveň zabraňovalo úniku. To mělo tu výhodu, že eliminovalo migraci jako možné vysvětlení výsledků. Zásoby obsahující inverze se známou počáteční frekvencí mohou být udržovány v kontrolovaných podmínkách. Bylo zjištěno, že různé typy chromozomů nekolísají náhodně, jak by tomu bylo, kdyby byly selektivně neutrální, ale přizpůsobují se určitým frekvencím, při kterých se stabilizují. V době, kdy Dobzhansky v roce 1951 vydal třetí vydání své knihy, byl přesvědčen, že chromozomové morfy jsou udržovány v populaci selektivní výhodou heterozygotů, jako u většiny polymorfismů.
Lidské početní abnormality
S příchodem postupů, které umožnily snadné vyčíslení chromozomů, byly rychle objeveny abnormality vyplývající z neddysjuncčních událostí, které způsobují buňky s aneuploidií (přírůstky nebo delece celých chromozomů). V roce 1959 Lejeune zjistil, že pacienti s Downovým syndromem mají navíc kopii chromozomu 21. Downův syndrom je také označován jako trisomie 21. V roce 1960 Nowell objevil malý chromozom, přezdívaný Philadelphia chromozom, který byl prokázán jako příčina chronické myelogenní leukémie. O 13 let později to bylo prokázáno Janet Rowley jako translokace chromozomů 9 a 22.
Mezi další objevené numerické abnormality patří abnormality pohlavních chromozomů. Jedinec s pouze jedním pohlavním chromozomem (X) má Turnerův syndrom, další chromozom X u samce, jehož výsledkem je celkem 47 chromozomů, má Klinefelterův syndrom. Mnoho dalších kombinací pohlavních chromozomů je kompatibilních s živým porodem včetně XXX, XYY a XXXX. Schopnost savců tolerovat aneuploidie v pohlavních chromozomech vyplývá ze schopnosti je inaktivovat, což je u normálních samic vyžadováno pro kompenzaci přítomnosti dvou kopií chromozomu. Ne všechny geny na chromozomu X jsou inaktivovány, což je důvod, proč je u jedinců s extra nebo chybějícím X pozorován fenotypový efekt.
Trisomie 13 byla spojována s Patauovým syndromem a trisomie 18 s Edwardovým syndromem.
Advent bandingových technik
Koncem šedesátých let vyvinul Caspersson páskovací techniky, které diferenciálně barví chromozomy. To umožňuje diferencovat chromozomy jinak stejné velikosti a také objasnit hraniční hodnoty a základní chromozomy podílející se na translokacích chromozomů. Výmazy v rámci jednoho chromozomu by také mohly být nyní konkrétněji pojmenovány a pochopeny. Zjistilo se, že delecí syndromy jako DiGeorgeův syndrom, Prader-Williho syndrom a další jsou způsobeny delecí v materiálu chromozomů.
Diagramy identifikující chromozomy na základě vzorů pruhování jsou známé jako cytogenetické mapy. Tyto mapy se staly základem pro prenatální i onkologické obory k rychlému přesunu cytogenetiky do klinické laboratoře, kde karyotypizace umožnila vědcům hledat chromozomální změny. Techniky byly rozšířeny, aby umožnily kultivaci volných amniocytů získaných z plodové vody, a techniky prodloužení pro všechny typy kultur, které umožňují pruhování s vyšším rozlišením.
Počátky molekulární cytogenetiky
V 80. letech byl učiněn pokrok v molekulární cytogenetice. Zatímco sondy značené radioizotopy byly od roku 1969 hybridizovány s DNA, nyní byl učiněn posun v použití fluorescenčně značených sond. Jejich hybridizace na chromozomové přípravky vyrobené za použití stávajících technik vešla ve známost jako fluorescenční in situ hybridizace (FISH). Tato změna výrazně zvýšila využití sondážních technik, protože fluorescenčně značené sondy jsou bezpečnější a mohou být používány téměř neomezeně. Další pokrok v mikromanipulaci a zkoumání chromozomů vedl k technice mikrodisekce chromozomů, kdy aberace v chromozomální struktuře mohly být izolovány, klonovány a studovány ve stále větších detailech.
translokace 9;11 spojená s AML
U některých forem rakoviny, zejména u hematologických malignit, může cytogenetika určit, které chromozomální translokace a fúzní geny jsou přítomny v maligních buňkách, což usnadňuje diagnostiku a náchylnost k léčbě (např. imatinib mesylát za přítomnosti chromozomu Philadelphia).
U vrozených poruch, jako je Downův syndrom, může cytogenetika určit povahu chromozomálního defektu – „jednoduchá“ trisomie, mozaika, „vyvážená“ translokace, delece nebo vložení do jednoho – nebo obou – rodičů nebo do plodu.
S příchodem sklizňových procedur, které umožňovaly snadné vyčíslení chromozomů, byly rychle objeveny abnormality vyplývající z neddysjunckčních událostí, které způsobují buňky s aneusomií (přírůstky nebo delece celých chromozomů). V roce 1959 Lejeune zjistil, že pacienti s Downovým syndromem mají navíc kopii chromozomu 21. Downův syndrom je také označován jako trisomie 21. V roce 1960 Nowell objevil malý chromozom, přezdívaný Philadelphia chromozom, který byl prokázán jako příčina chronické myelogenní leukémie. O 13 let později to Janet Rowleyová prokázala jako translokaci chromozomů 9 a 22.
Mezi další objevené numerické abnormality patří abnormality pohlavních chromozomů. Jedinec s pouze jedním pohlavním chromozomem (X) má Turnerův syndrom, další chromozom X u samce, jehož výsledkem je celkem 47 chromozomů, má Klinefelterův syndrom. Mnoho dalších kombinací pohlavních chromozomů je kompatibilních s živým porodem včetně XXX, XYY a XXXX. Schopnost savců tolerovat aneusomie v pohlavních chromozomech vyplývá ze schopnosti je inaktivovat, což je u normálních samic vyžadováno pro kompenzaci přítomnosti dvou kopií chromozomu.
Trisomie 13 byla spojována s Patauovým syndromem a trisomie 18 s Edwardovým syndromem.
Rutinní analýza chromozomů odkazuje na analýzu metafázových chromozomů, které byly obaleny pomocí trypsinu následovaného Giemsou, Leishmannsem nebo směsí obou. Tím se na chromozomech vytvoří unikátní vzory obalů. Molekulární mechanismus a důvod těchto vzorů není znám, i když pravděpodobně souvisel s načasováním replikace a obalem chromatinu.
V cytogenetických laboratořích se používá několik technik chromozomového bandingu. Quinakrinové bandování (Q-banding) byla první metoda barvení používaná k vytvoření specifických páskových vzorů. Tato metoda vyžaduje fluorescenční mikroskop a již není tak široce používána jako Giemsovo bandování (G-banding). Reverzní banding (R-banding) vyžaduje tepelné ošetření a obrací obvyklý bílý a černý vzor, který je vidět v G-pásmech a Q-pásmech. Tato metoda je zvláště užitečná pro barvení distálních konců chromozomů. Mezi další techniky barvení patří C-banding a barvení nukleolárních organizujících oblastí (NOR stains). Tyto posledně jmenované metody specificky barví určité části chromozomu. C-banding barví konstitutivní heterochromatin, který obvykle leží v blízkosti centromery, a NOR barvení zvýrazňuje satelity a stonky akrocentrických chromozomů.
Vysoké rozlišení bandingu zahrnuje barvení chromozomů během propázy nebo rané metafáze (prometapázy), dříve než dosáhnou maximální kondenzace. Vzhledem k tomu, že chromozomy profázy a prometapázy jsou rozšířenější než chromozomy metafáze, počet pásem pozorovatelných pro všechny chromozomy se zvyšuje z asi 300 na 450 až na 800. To umožňuje detekci méně zřejmých abnormalit, které obvykle nejsou pozorovány u konvenčního bandingu.
Buňky z kostní dřeně, krve, plodové vody, pupečníkové krve, nádoru a tkání (včetně kůže, pupeční šňůry, jater a mnoha dalších orgánů) lze kultivovat pomocí standardních technik buněčné kultury, aby se jejich počet zvýšil. Do kultury se pak přidá mitotický inhibitor (kolchicin, kolcemid). Tím se zastaví dělení buněk při mitóze, což umožňuje zvýšený výnos mitotických buněk pro analýzu. Buňky se pak odstředí a odstraní se média a mitotický inhibitor a nahradí se hypotonickým roztokem. To způsobí, že buňky nabobtnají tak, že se chromozomy po přidání do sklíčka rozšíří. Poté, co se buňky nechají v hypotonickém stavu, přidá se Carnoyův fixativ (metanol 3:1 na ledovou kyselinu octovou). Tím se buňky usmrtí, červené krvinky se rozpadnou a jádra zbývajících bílých krvinek se ztvrdnou. Buňky se zpravidla opakovaně fixují, aby se odstranily veškeré zbytky nebo zbývající červené krvinky. Buněčná suspenze se pak upustí na vzorky sklíček. Po stárnutí preparátů v peci nebo po několikadenním čekání jsou připraveny k bandážování a analýze.
Analýzu pruhovaných chromozomů provádí pod mikroskopem klinický laboratorní specialista v cytogenetice (CLSp(CG)). Obecně se analyzuje 20 buněk, což stačí k vyloučení mozaiky na přijatelnou úroveň. Výsledky se shrnou a předají k přezkoumání lékařskému genetikovi s atestací a patologovi a k napsání interpretace s přihlédnutím k předchozí anamnéze pacientů a dalším klinickým nálezům. Výsledky se pak předají uvedené v Mezinárodním systému pro cytogenetickou nomenklaturu člověka 2005 (ISCN2005).
Fluorescenční in situ hybridizace
Interfázové buňky pozitivní pro přesmyk t(9;22)
Fluorescenční in situ hybridizace odkazuje na použití fluorescenčně značené sondy k hybridizaci na cytogenetické buněčné preparáty.
Kromě standardních přípravků lze FISH provádět také na:
Tato část se týká přípravy standardních cytogenetických přípravků
Sklíčko zraje za použití solného roztoku, který se obvykle skládá z 2X SSC (sůl, citrát sodný). Sklíčka se poté dehydratují v ethanolu a přidá se sondážní směs. Vzorek DNA a sondážní DNA se pak za použití vyhřívané desky společně denaturují a nechají se znovu žíhat po dobu nejméně 4 hodin. Sklíčka se poté omyjí, aby se odstranila přebytečná nenavázaná sonda, a obarví se 4′,6-Diamidino-2-fenylindolem (DAPI) nebo jodidem propidium.
Analýzu FISH vzorků provádí fluorescenční mikroskopie klinický laboratorní specialista v cytogenetice (CLSp(CG)). U onkologie se obecně hodnotí velký počet interfázových buněk, aby se vyloučila nízká úroveň reziduálního onemocnění, obvykle se počítá a hodnotí 200 až 1000 buněk. U vrozených problémů se obvykle hodnotí 20 metafázových buněk.
Pokroky se nyní zaměřují na molekulární cytogenetiku včetně automatizovaných systémů pro počítání výsledků standardních FISH preparátů a technik pro virtuální karyotypizaci, jako jsou komparativní genomová hybridizační pole, CGH a Single nucleotide polymorphism-arrays.