Klasické nastavení patch clamp, s mikroskopem, antivibračním stolem a mikro manipulátory
Záznam záplatové svorky odhaluje přechody mezi dvěma stavy vodivosti jednoho iontového kanálu: uzavřený (nahoře) a otevřený (dole).
Technika patch clamp je laboratorní technika v elektrofyziologii, která umožňuje studium jednotlivých nebo více iontových kanálů v buňkách. Technika může být aplikována na širokou škálu buněk, ale je zvláště užitečná při studiu excitovatelných buněk, jako jsou neurony, kardiomyocyty, svalová vlákna a beta buňky pankreatu. Může být také aplikována při studiu bakteriálních iontových kanálů ve speciálně připravených obřích spheroplastech.
Technika záplatové svorky je zdokonalením napěťové svorky. Erwin Neher a Bert Sakmann vyvinuli záplatovou svorku na přelomu 70. a 80. let. Tento objev umožnil poprvé zaznamenat proudy jednotlivých iontových kanálů, což dokazuje jejich zapojení do základních buněčných procesů, jako je vedení akčního potenciálu. Neher a Sakmann obdrželi v roce 1991 za tuto práci Nobelovu cenu za fyziologii nebo medicínu.
Schematické znázornění zařízení pro stahování pipet, které slouží k přípravě mikropipet pro svorku náplasti a další záznamy
Bakteriální spheroplast záplatovaný skleněnou pipetou
Záznam objímky využívá jako elektrodu skleněnou mikropipetu, která má otevřený průměr hrotu přibližně jeden mikrometr, velikost uzavírající povrch membrány nebo „náplast“, která často obsahuje jen jednu nebo několik molekul iontového kanálu. Tento typ elektrody se liší od „ostré mikroelektrody“, která se používá k napichování buněk v tradičních intracelulárních záznamech, tím, že je těsněna na povrchu buněčné membrány, místo aby se přes ni vkládala. V některých experimentech je špička mikropipety zahřívána v mikrokovárně, aby se vytvořil hladký povrch, který napomáhá vytvoření těsnění s vysokým odporem s buněčnou membránou. Vnitřek pipety je vyplněn roztokem odpovídajícím iontovému složení koupelového roztoku, jako v případě záznamu připojeného k buňce, nebo cytoplazmou pro celobuněčný záznam. Do kontaktu s tímto roztokem je vložen chlorovaný stříbrný drát a vede elektrický proud do zesilovače. Zkoušející může změnit složení tohoto roztoku nebo přidat léky ke studiu iontových kanálů za různých podmínek. Mikropipeta je přitlačena k buněčné membráně a je přisáta, aby pomohla při tvorbě těsnění s vysokým odporem mezi sklem a buněčnou membránou (tzv. „gigaohmové těsnění“ nebo „gigaseal“, protože elektrický odpor tohoto těsnění je vyšší než gigaohm). Vysoký odpor tohoto těsnění umožňuje elektronicky izolovat proudy naměřené přes membránovou náplast s malým konkurenčním hlukem a také poskytuje určitou mechanickou stabilitu záznamu.
Na rozdíl od tradičních záznamů dvou elektrodových napěťových svorek, záznam záplatových svorek používá k záznamu proudů jedinou elektrodu. Mnoho zesilovačů záplatových svorek nepoužívá obvody s pravou napěťovou svorkou, ale místo toho jsou to diferenciální zesilovače, které používají koupelovou elektrodu k nastavení nulové úrovně proudu. To umožňuje výzkumníkovi udržovat konstantní napětí při pozorování změn proudu. Případně může být buňka proudově svorkována v režimu celé buňky, udržuje konstantní proud při pozorování změn membránového napětí.
Svorka patch připojená k buňce používá mikropipetu připojenou k buněčné membráně, která umožňuje záznam z jednoho iontového kanálu.
Lze použít několik variant základní techniky v závislosti na tom, co chce výzkumník studovat. Techniky zevnitř ven a zevnitř se nazývají techniky „vyříznuté náplasti“, protože náplast je vyříznuta (odstraněna) z hlavního těla buňky. Techniky spojené s buňkou a obě techniky vyříznuté náplasti se používají ke studiu chování jednotlivých iontových kanálů v části membrány připojené k elektrodě.
Celobuněčná náplast a perforovaná náplast umožňují výzkumníkovi studovat elektrické chování celé buňky místo jednokanálových proudů. Celobuněčná náplast, která umožňuje elektrický přístup s nízkým odporem do vnitřku buňky, nyní z velké části nahradila vysokoodporové mikroelektrodové záznamové techniky pro záznam proudů přes celou buněčnou membránu.
Schéma znázorňující varianty techniky svorky náplasti
Náplast připojená k buňce nebo na buňce
Elektroda je připevněna k záplatě membrány a buňka zůstává neporušená. To umožňuje záznam proudů přes jednotlivé iontové kanály v této záplatě membrány, aniž by byl narušen vnitřek buňky. U ligandem řízených iontových kanálů nebo kanálů, které jsou modulovány metabotropními receptory, je zkoumaný neurotransmiter nebo lék obvykle obsažen v roztoku pipety, kde může navázat kontakt s tím, co bývalo vnějším povrchem membrány. Zatímco výslednou aktivitu kanálu lze připsat použitému léku, obvykle není možné pak změnit koncentraci léku. Technika je tak omezena na jeden bod křivky odezvy dávky na jednu náplast. Obvykle je odezva dávky dosažena pomocí několika buněk a záplat. Nicméně napěťově řízené iontové kanály mohou být upnuty na různé potenciály membrány pomocí stejné náplasti. To má za následek odstupňovanou aktivaci kanálu a úplnou křivku I-V (proudové napětí) lze vytvořit pouze s jednou náplastí.
Po vytvoření gigasealu je mikropipeta z buňky rychle vytažena, čímž se z buňky vytrhne membránová náplast, náplast membrány zůstane připojena k mikropipetě a intracelulární povrch membrány se vystaví vnějším médiím. To je užitečné v případě, kdy si experimentátor přeje manipulovat s prostředím na intracelulárním povrchu iontových kanálů. Například kanály, které jsou aktivovány intracelulárními ligandy, pak mohou být studovány v rozmezí koncentrací ligandů.
Celobuněčný záznam nebo celobuněčná náplast
Celobuněčný záznam nervové buňky z hipokampu. Pipeta na fotografii byla označena světle modrou barvou.
Celobuněčný záznam naopak zahrnuje záznam proudů přes více kanálů najednou, přes membránu celé buňky. Elektroda je ponechána na místě na buňce, ale větší odsávání je aplikováno na protržení membránové náplasti, čímž je zajištěn přístup do vnitrobuněčného prostoru buňky. Výhodou celobuněčného záznamu náplasti oproti ostrému záznamu mikroelektrody je, že větší otvor na špičce náplasti svorkové elektrody poskytuje nižší odpor a tím lepší elektrický přístup do vnitřku buňky. Nevýhodou této techniky je, že objem elektrody je větší než v buňce, takže rozpustný obsah vnitřku buňky bude pomalu nahrazen obsahem elektrody. To se označuje jako elektroda „dialyzující“ obsah buňky. Tím se změní všechny vlastnosti buňky, které jsou závislé na rozpustném vnitrobuněčném obsahu. Použitý roztok pipety se obvykle přibližuje vysokodraselnému prostředí vnitřku buňky. Obecně lze říci, že na začátku celobuněčného záznamu je období trvající přibližně 10 minut, kdy lze provést měření před dialýzou buňky.
Po vytvoření celobuněčné náplasti může být elektroda pomalu vytažena z buňky, což umožní, aby baňka membrány vyfoukla ven z buňky. Když je elektroda vytažena dostatečně daleko, tato náplast se oddělí od buňky a zreformuje se jako konvexní membrána na konci elektrody (jako kulička otevřená na špičce elektrody), přičemž původní vnější strana membrány směřuje ven z elektrody. Záznamy s jedním kanálem jsou v této konformaci možné, pokud je náplast membrány dostatečně malá. Mimo-out náplast dává experimentátorovi možnost zkoumat vlastnosti iontového kanálu, když je izolován od buňky, a vystaven různým roztokům na extracelulárním povrchu membrány. Experimentátor může prostoupit stejnou náplast různými roztoky, a pokud je kanál aktivován z extracelulárního povrchu, pak může být získána křivka závislosti dávky na odezvě. To je zřetelná výhoda vnější-out náplasti v porovnání s metodou připojenou k buňce. Je to však obtížnější, protože do procesu záplatování je zapojeno více kroků.
V této variaci záznamu celé buňky experimentátor vytvoří gigaohmové těsnění, ale nepoužívá sání k protržení membrány náplasti. Místo toho roztok elektrody obsahuje malé množství antimykotického nebo antibiotického činidla, jako je amfotericin-B, nystatin nebo gramicidin. Jak se antibiotické molekuly difundují do membránové náplasti, vytvářejí malé perforace v membráně, které zajišťují elektrický přístup do vnitřku buňky. To má výhodu v tom, že snižuje dialýzu buňky, ke které dochází při záznamu celé buňky, ale také má několik nevýhod. Za prvé, přístupový odpor je vyšší, oproti celé buňce, vzhledem k částečné membráně zabírající špičku elektrody (přístupový odpor je součtem elektrodového odporu a odporu při spojení elektrody s buňkou). To sníží elektrický přístup a tím sníží rozlišení proudu, zvýší šum záznamu a zvětší jakoukoliv chybu sériového odporu. Za druhé, může trvat značné množství času, než antibiotikum proděraví membránu (10-30 minut, i když to lze snížit správně tvarovanými elektrodami). Za třetí, membrána pod špičkou elektrody je oslabena perforacemi vytvořenými antibiotikem a může prasknout. Pokud se náplast protrhne, záznam je pak v celobuněčném režimu, přičemž antibiotikum kontaminuje vnitřek buňky.
Uvolněná svorka na záplaty je odlišná v tom, že využívá volné těsnění spíše než těsný gigaseal používaný konvenční technikou. Významnou výhodou volného těsnění je, že použitá pipeta může být po zaznamenání opakovaně odstraněna z membrány a membrána zůstane neporušená. To umožňuje opakovaná měření na různých místech na stejné buňce, aniž by byla narušena integrita membrány. Velkou nevýhodou je, že odpor mezi pipetou a membránou je značně snížen, což umožňuje, aby proud unikal těsněním. Tento únik však může být korigován, což nabízí možnost porovnat a kontrastovat záznamy pořízené z různých oblastí na sledované buňce.
V poslední době byly vyvinuty automatizované systémy patch clamp s cílem levně shromáždit velké množství dat v kratším časovém úseku. Takové systémy obvykle zahrnují mikrofluidní zařízení na jedno použití, buď vstřikovací lis nebo PDMS litý čip, k zachycení buňky nebo buněk, a integrovanou elektrodu.