Molekulární biologie je studium biologie na molekulární úrovni. Obor se překrývá s dalšími oblastmi biologie a chemie, zejména s genetikou a biochemií. Molekulární biologie se zabývá především chápáním interakcí mezi různými systémy buňky, včetně vzájemného vztahu syntézy DNA, RNA a proteinů a poznáváním, jak jsou tyto interakce regulovány.
Psaní v přírodě, William Astbury popsal molekulární biologie as1:
„… ani ne tak technikou, jako přístupem, přístupem z hlediska tzv. základních věd s vedoucí myšlenkou hledat pod velkoplošnými projevy klasické biologie odpovídající molekulární plán. Zabývá se zejména formami biologických molekul a ….. je převážně trojrozměrný a strukturní – což však neznamená, že jde pouze o upřesnění morfologie – musí se zároveň zabývat genezí a funkcí“
Vztah k jiným biologickým vědám v „molekulárním měřítku“
Schematický vztah mezi biochemií, genetikou a molekulární biologií
Výzkumníci v molekulární biologii používají specifické techniky vlastní molekulární biologii (viz sekce Techniky později v článku), ale stále více je kombinují s technikami a myšlenkami z genetiky, biochemie a biofyziky. Mezi těmito disciplínami není pevná hranice jako kdysi. Následující obrázek je schematický, který znázorňuje jeden možný pohled na vztah mezi obory:
Velká část práce v molekulární biologii je kvantitativní a v poslední době se hodně pracuje na rozhraní molekulární biologie a počítačové vědy v bioinformatice a výpočetní biologii. Od počátku 21. století patří studium genové struktury a funkce, molekulární genetiky, mezi nejvýznamnější dílčí obory molekulární biologie.
Stále více dalších oblastí biologie se zaměřuje na molekuly, buď přímo studují jejich interakce samy o sobě, jako například v buněčné biologii a vývojové biologii, nebo nepřímo, kde se techniky molekulární biologie používají k odvození historických atributů populací nebo druhů, jako v oblastech evoluční biologie, jako je populační genetika a fylogenetika. Existuje také dlouhá tradice studia biomolekul „od základů“ v biofyzice.
Techniky molekulární biologie
Od konce 50. a začátku 60. let 20. století se molekulární biologové naučili charakterizovat, izolovat a manipulovat s molekulárními složkami buněk a organismů. Tyto složky zahrnují DNA, úložiště genetické informace; RNA, blízkého příbuzného DNA, jehož funkce sahají od toho, že slouží jako dočasná pracovní kopie DNA až po skutečné strukturální a enzymatické funkce, jakož i funkční a strukturální část translačního aparátu; a proteiny, hlavní strukturální a enzymatický typ molekuly v buňkách.
Jednou z nejzákladnějších technik molekulární biologie pro studium proteinové funkce je expresní klonování. Při této technice je DNA kódující sledovaný protein klonována (pomocí PCR a/nebo restrikčních enzymů) do plazmidu (známého jako expresní vektor). Tento plazmid může mít speciální promotorové prvky, které řídí produkci sledovaného proteinu, a může mít také markery antibiotické rezistence, které pomáhají plazmid sledovat.
Tento plasmid může být vložen buď do bakteriálních nebo živočišných buněk. Zavádění DNA do bakteriálních buněk se nazývá transformace a může být dokončeno několika metodami, včetně elektroporace, mikroinjekce, pasivního vychytávání a konjugace. Zavádění DNA do eukaryotických buněk, jako jsou živočišné buňky, se nazývá transfekce. K dispozici je několik různých transfekčních technik, včetně transfekce fosforečnanu vápenatého, transfekce lipozomů a vlastnických transfekčních činidel, jako je Fugene. DNA může být také zavedena do buněk pomocí virů nebo patogenních bakterií jako nosičů. V takových případech se tato technika nazývá virová/bakteriální transdukce a buňky jsou prý transdukovány.
V obou případech je nyní DNA kódující sledovaný protein uvnitř buňky a bílkovina může být nyní exprimována. K dispozici je celá řada systémů, jako jsou indukovatelné promotory a specifické buněčné signalizační faktory, které pomáhají vyjádřit sledovaný protein ve vysoké míře. Z bakteriální nebo eukaryotické buňky pak může být extrahováno velké množství proteinu. Protein může být testován na enzymatickou aktivitu v různých situacích, protein může být krystalizován, aby mohla být studována jeho terciální struktura, nebo ve farmaceutickém průmyslu může být studována aktivita nových léků proti proteinu.
Polymerázová řetězová reakce (PCR)
Hlavní článek: Polymerázová řetězová reakce
Polymerázová řetězová reakce je extrémně všestranná technika kopírování DNA. Stručně řečeno, PCR umožňuje kopírovat jednu sekvenci DNA (miliónkrát), nebo ji měnit předem stanovenými způsoby. PCR může být například použita k zavedení restriktivních enzymatických míst, nebo k mutaci (změně) určitých bází DNA. PCR může být také použita k určení, zda se konkrétní fragment DNA nachází v cDNA knihovně.
Hlavní článek: Gelová elektroforéza
Gelová elektroforéza je jedním z hlavních nástrojů molekulární biologie. Základním principem je, že DNA, RNA a proteiny mohou být odděleny pomocí elektrického pole. V agarózové gelové elektroforéze mohou být DNA a RNA odděleny na základě velikosti tak, že DNA projede agarózovým gelem. Proteiny mohou být odděleny na základě velikosti pomocí SDS-PAGE gelu. Proteiny mohou být také odděleny na základě jejich elektrického náboje pomocí toho, co je známo jako isoelektrický gel.
Hlavní článek: Jižanská skvrna
Southern blot je technika používaná ke zjištění informací o molekulové hmotnosti a relativním množství sledované sekvence DNA. Test poprvé vyvinul Edwin Southern a je kombinací gelové elektroforézy DNA (často nejprve fragmentované restrikčním enzymovým trávením), přenosu téhož na nabitou membránu a hybridizace označené DNA sondy. Po hybridizaci se membrána omyje, aby se odstranila nenavázaná sonda, a snímek získaný pomocí autoradiografie nebo pomocí zařízení, jako je fosfatázor. Snímek označí místo (místa), na které se sonda hybridizovala, přičemž intenzita pozorovaného signálu slouží jako míra relativní hojnosti.
Hlavní článek: Kaňka severní
Severní skvrna se používá ke studiu expresních vzorců specifického typu molekuly RNA jako relativní srovnání souboru různých vzorků RNA. Jde v podstatě o kombinaci denaturační elektroforézy RNA gelu a skvrny. V tomto procesu je RNA oddělena na základě velikosti a poté přenesena na membránu, která je pak sondována s označeným komplementem sledu zájmu. Výsledky mohou být vizualizovány různými způsoby v závislosti na použitém štítku, nicméně většina z nich vede k odhalení pásem představujících velikost RNA detekované ve vzorku. Intenzita těchto pásem souvisí s množstvím cílové RNA v analyzovaných vzorcích. Postup se běžně používá ke studiu toho, kdy a kolik genové exprese se vyskytuje, měřením toho, kolik této RNA je přítomno v různých vzorcích. Je to jeden z nejzákladnějších nástrojů pro určení toho, kdy jsou určité geny exprimovány v živých tkáních.
Western blotting a imunochemie
Hlavní článek: Western blot
Protilátky proti většině bílkovin lze vytvořit injekcí malého množství bílkoviny do zvířete, jako je myš, králík, ovce nebo osel. Tyto protilátky lze použít pro celou řadu analytických a prepraktivních technik.
V západním blottingu jsou bílkoviny nejprve odděleny podle velikosti, v tenkém gelu vmáčknutém mezi dvě skleněné desky. Tato technika se nazývá SDS-PAGE (pro sodnou dodecylsulfátovou poly-akrylamidovou gelovou elektroforézu). Bílkoviny v gelu jsou pak přeneseny do PVDF, nitrocelulózy, nylonu nebo jiné podpůrné membrány. Tato membrána pak může být sondována roztoky protilátek. Protilátky, které se specificky vážou na sledovanou bílkovinu, pak mohou být vizualizovány různými technikami, včetně chemiluminiscence nebo radioaktivity.
Protilátky mohou být také použity k čištění bílkovin. Vytvoří se protilátky proti bílkovině, které se pak často spojí s „kuličkami“. Poté, co se protilátka naváže na bílkovinu, která je předmětem zájmu, může být tento komplex protilátek a bílkovin centrifugací oddělen od všech ostatních bílkovin. Během centrifugace kuličky, na které se protilátka naváže, peletují (čímž se sledovaná bílkovina spojí s ní), zatímco všechny ostatní bílkoviny zůstanou v roztoku. Alternativně mohou být protilátky vázané na pevnou nosnou matrici, jako jsou například Sephadex nebo Sepharose kuličky, použity k odstranění sledované bílkoviny ze složitého roztoku. Po odplavení nevázaných a specificky nevázaných materiálů z „kuliček“ je sledovaná bílkovina pak eluována z matrice, obvykle přidáním roztoku s vysokou koncentrací soli nebo změnou pH roztoku, ve kterém je matrice obsažena. Kuličky mohou být buď suspendovány v roztoku (dávkové zpracování), nebo zabaleny do zkumavky (kolonové zpracování).
Molekulární biologie byla založena ve 30. letech 20. století, termín poprvé zavedl Warren Weaver v roce 1938 nicméně. Warren byl ředitelem přírodních věd pro Rockefellerovu nadaci v té době a věřil, že biologie se chystá projít obdobím významných změn vzhledem k nedávnému pokroku v oblastech, jako je rentgenová krystalografie. Proto nasměroval značné množství (Rockefellerův institut) peněz do biologických oblastí.
4. vydání, Routledge, březen, 2002, vázaná vazba, 1616 stran, 7,6 libry, ISBN 0815332181
3. vydání, Garland, 1994, ISBN 0815316208
2. vydání, Garland, 1989, ISBN 0824036956