Genový knockout (zkratka KO) je genetická technika, při níž je organismus upraven tak, aby nesl geny, které byly v organismu vyřazeny z činnosti (byly „vyřazeny“). To se provádí pro výzkumné účely. Známé také jako knockoutované organismy nebo jednoduše knockouty se používají při poznávání genu, který byl sekvenován, ale jehož funkce je neznámá nebo neúplně známá. Výzkumníci vyvozují závěry z rozdílů mezi knockoutovaným organismem a normálními jedinci.
Tento termín se vztahuje také na proces vytvoření takového organismu, jako je „vyřazení“ genu. Tato technika je v podstatě opakem techniky genového knock-inu. Knockout se často označuje zkratkou KO. Vyřazení dvou genů současně v organismu se označuje jako dvojité vyřazení (DKO). Podobně se pro označení 3, resp. 4 vyřazených genů používají termíny trojitý knockout (TKO) a čtyřnásobný knockout (QKO).
Knockoutování se provádí kombinací technik, počínaje zkumavkou s plazmidem, bakteriálním umělým chromozomem nebo jiným DNA konstruktem, a konče buněčnou kulturou. Jednotlivé buňky jsou geneticky transformovány konstruktem DNA. Často je cílem vytvořit transgenní zvíře, které má změněný gen. V takovém případě se geneticky transformují embryonální kmenové buňky a vloží se do raných embryí. Výsledná zvířata s genetickou změnou v zárodečných buňkách pak mohou často předat vyřazený gen budoucím generacím.
Konstrukt je upraven tak, aby se rekombinoval s cílovým genem, čehož se dosáhne začleněním sekvencí z vlastního genu do konstruktu. K rekombinaci pak dochází v oblasti této sekvence uvnitř genu, což vede k vložení cizí sekvence, která gen naruší. S přerušenou sekvencí se změněný gen ve většině případů přeloží do nefunkčního proteinu, pokud se vůbec přeloží.
Podmíněný knockout umožňuje odstranění genu tkáňově nebo časově specifickým způsobem. Toho se dosáhne zavedením krátkých sekvencí nazývaných loxP místa kolem genu. Tyto sekvence se zavedou do zárodečné linie stejným mechanismem jako knock-in. Tuto zárodečnou linii lze poté zkřížit s jinou zárodečnou linií obsahující Cre-rekombinázu, což je bakteriální enzym, který dokáže tyto sekvence rozpoznat, rekombinovat je a odstranit gen lemovaný těmito místy.
Vzhledem k tomu, že požadovaný typ rekombinace DNA je u většiny buněk a většiny konstruktů vzácnou událostí, cizí sekvence vybraná pro vložení obvykle obsahuje reportér. To umožňuje snadnou selekci buněk nebo jedinců, u nichž byla knockoutace úspěšná. Někdy se konstrukt DNA vloží do chromozomu bez požadované homologní rekombinace s cílovým genem. Aby se zabránilo izolaci takových buněk, obsahuje konstrukt DNA často druhou oblast DNA, která umožňuje takové buňky identifikovat a vyřadit.
U diploidních organismů, které obsahují dvě alely pro většinu genů a mohou obsahovat i několik příbuzných genů, které spolupracují ve stejné roli, se provádějí další kola transformace a selekce, dokud není vyřazen každý cílový gen. K získání homozygotních knockoutovaných zvířat může být zapotřebí selektivní šlechtění.
Knock-in se podobá knock-out, ale místo odstranění genu jej nahradí jiným.