Sekvenování DNA

Sekvenování DNA zahrnuje několik metod a technologií, které se používají pro stanovení pořadí nukleotidových bází – adeninu, guaninu, cytosinu a thyminu – v molekule DNA.

Znalost sekvencí DNA se stala nepostradatelnou pro základní biologický výzkum, další výzkumné obory využívající sekvenování DNA a pro četné aplikované obory, jako je diagnostika, biotechnologie, forenzní biologie a biologická systematika. Nástup sekvenování DNA významně urychlil biologický výzkum a objevy. Rychlá rychlost sekvenování dosažená moderní technologií sekvenování DNA se významně podílela na sekvenování lidského genomu, a to v rámci projektu Lidský genom. Související projekty, často na základě vědecké spolupráce napříč kontinenty, vytvořily kompletní sekvence DNA mnoha živočišných, rostlinných a mikrobiálních genomů.

První sekvence DNA byly získány počátkem 70. let akademickými výzkumníky pomocí pracných metod založených na dvourozměrné chromatografii. Po vývoji sekvenovacích metod založených na barvivu s automatizovanou analýzou se sekvenování DNA stalo snadnějším a řádově rychlejším.

Sekvenování RNA bylo jednou z prvních forem sekvenování nukleotidů. Hlavním mezníkem sekvenování RNA je sekvence prvního kompletního genu a kompletního genomu bakteriofágu MS2, který v letech 1972 až 1976 identifikoval a publikoval Walter Fiers a jeho spolupracovníci na univerzitě v Gentu (Belgie).

Před vývojem metod rychlého sekvenování DNA na počátku 70. let Frederickem Sangerem na univerzitě v Cambridge v Anglii a Walterem Gilbertem a Allanem Maxamem na Harvardu byla použita řada pracných metod. Například v roce 1973 Gilbert a Maxam ohlásili sekvenci 24 basepair pomocí metody známé jako analýza putování.

Metoda ukončení řetězce vyvinutá Sangerem a spolupracovníky v roce 1977 se brzy stala metodou volby, díky své relativní snadnosti a spolehlivosti. Zahrnuje oddělení bází DNA od různých fragmentů DNA. [citace nutná]

V letech 1976-1977 Allan Maxam a Walter Gilbert vyvinuli metodu sekvenování DNA založenou na chemické modifikaci DNA a následném štěpení na specifických základech.
Ačkoliv Maxam a Gilbert publikovali svou metodu chemického sekvenování dva roky po přelomovém článku Sangera a Coulsona o sekvenování plus-minus, Maxamovo-Gilbertovo sekvenování se rychle stalo populárnějším, protože vyčištěná DNA mohla být použita přímo, zatímco původní Sangerova metoda vyžadovala, aby každý přečtený začátek byl klonován pro výrobu jednovláknové DNA. Nicméně se zlepšením metody ukončení řetězce (viz níže) upadlo Maxamovo-Gilbertovo sekvenování v nemilost kvůli jeho technické složitosti, která zakazuje jeho použití ve standardních soupravách molekulární biologie, rozsáhlému používání nebezpečných chemikálií a potížím s rozšiřováním.

Metoda vyžaduje radioaktivní značení na jednom 5′ konci DNA (typicky kinázovou reakcí s použitím gama-32P ATP) a purifikaci fragmentu DNA, který má být sekvenován. Chemické zpracování generuje zlomy na malém podílu jedné nebo dvou ze čtyř nukleotidových bází v každé ze čtyř reakcí (G, A+G, C, C+T). Například puriny (A+G) jsou depurovány pomocí kyseliny mravenčí, guaniny (a do určité míry adeniny) jsou methylovány dimethylsulfátem a pyrimidiny (C+T) jsou methylovány pomocí hydrazinu. Přidání soli (chloridu sodného) k hydrazinové reakci inhibuje methylaci thyminu pro C-pouze reakci. Upravené DNA jsou pak rozštěpeny horkým piperidinem na pozici modifikované báze. Koncentrace modifikujících chemikálií je řízena tak, aby se v průměru zavedla jedna modifikace na molekulu DNA. Tak vzniká řada značených fragmentů, od radioaktivně značeného konce k prvnímu místu „řezu“ v každé molekule. Fragmenty ve čtyřech reakcích jsou elektroforizovány vedle sebe v denaturačních akrylamidových gelech pro oddělení velikosti. Pro vizualizaci fragmentů je gel vystaven rentgenovému filmu pro autoradiografii, čímž vzniká řada tmavých pásů, z nichž každý odpovídá radioaktivně značenému fragmentu DNA, z nichž lze odvodit posloupnost.

Někdy také známá jako „chemické sekvenování“, tato metoda vedla k Methylation Interference Assay používané k mapování vazebných míst DNA pro proteiny vázající DNA.

Část radioaktivně značeného sekvenčního gelu

Protože metoda řetězového terminátoru (nebo Sangerova metoda podle jejího vývojáře Fredericka Sangera) je efektivnější a používá méně toxických chemikálií a nižší množství radioaktivity než metoda Maxama a Gilberta, rychle se stala metodou volby. Klíčovým principem Sangerovy metody bylo použití dideoxynukleotid trifosfátů (ddNTP) jako terminátorů řetězce DNA.

Klasická metoda ukončení řetězce vyžaduje jednovláknovou DNA šablonu, DNA primer, DNA polymerázu, normální deoxynukleotidetrifosfáty (dNTPs) a modifikované nukleotidy (dideoxyNTPs), které ukončují elongaci řetězce DNA. Tyto ddNTPs budou také radioaktivně nebo fluorescenčně označeny pro detekci v automatizovaných sekvenčních přístrojích. Vzorek DNA je rozdělen do čtyř samostatných sekvenčních reakcí, které obsahují všechny čtyři standardní deoxynukleotidy (dATP, dGTP, dCTP a dTTP) a DNA polymerázu. Ke každé reakci se přidá pouze jeden ze čtyř dideoxynukleotidů (ddATP, ddGTP, ddCTP nebo ddTTP), které jsou nukleotidy ukončující řetězec, postrádající 3′-OH skupinu potřebnou pro tvorbu fosfodiesterové vazby mezi dvěma nukleotidy, čímž končí prodloužení řetězce DNA a výsledkem jsou fragmenty DNA různé délky.

Nově syntetizované a označené fragmenty DNA jsou tepelně denaturovány a odděleny podle velikosti (s rozlišením pouze jednoho nukleotidu) gelovou elektroforézou na denaturačním polyakrylamidovo-močovinovém gelu, přičemž každá ze čtyř reakcí probíhá v jednom ze čtyř jednotlivých pruhů (pruhy A, T, G, C); pásma DNA jsou pak vizualizována autoradiografií nebo UV světlem a sekvenci DNA lze přímo přečíst z rentgenového filmu nebo gelového obrazu. Na obrázku vpravo byl rentgenový film vystaven gelu a tmavé pruhy odpovídají fragmentům DNA různých délek. Tmavý pruh v pruhu označuje fragment DNA, který je výsledkem ukončení řetězce po zabudování dideoxynukleotidu (ddATP, ddGTP, ddCTP nebo ddTTP). Relativní pozice různých pásem mezi čtyřmi pruhy jsou pak použity ke čtení (zdola nahoru) sekvence DNA.

Doporučujeme:  Analeptika

fragmenty DNA jsou označeny radioaktivní nebo fluorescenční značkou na primeru (1), v novém řetězci DNA označením dNTP, nebo označením ddNTP. (klikněte pro rozbalení)

Technické varianty sekvenování s ukončením řetězce zahrnují značení nukleotidy obsahujícími radioaktivní fosfor pro radioaktivní značení nebo použití primeru značeného na 5′ konci fluorescenčním barvivem. Sekvenování primeru usnadňuje čtení v optickém systému pro rychlejší a úspornější analýzu a automatizaci. Pozdější vývoj fluorescenčně značených ddNTP a primerů Leroyem Hoodem a spolupracovníky připravil půdu pro automatizované, vysoce výkonné sekvenování DNA.

Sequence ladder by radioactive sequencing compared to fluorescent peaks (click to expand)

Metody ukončení řetězce výrazně zjednodušily sekvenování DNA. Komerčně dostupné jsou například sady založené na ukončení řetězce, které obsahují činidla potřebná pro sekvenování, předem alikvitované a připravené k použití. Omezení zahrnují nespecifickou vazbu primeru na DNA, která ovlivňuje přesné odečtení sekvence DNA, a sekundární struktury DNA ovlivňující věrnost sekvence.

Kapilární elektroforéza (klikněte pro rozbalení)

Při sekvenování pomocí dye-terminátoru se využívá značení terminátoru řetězce ddNTP, což umožňuje sekvenování v jedné reakci, a nikoli ve čtyřech reakcích jako při metodě značeného primeru. Při sekvenování pomocí dye-terminátoru je každý ze čtyř koncovek dideoxynukleotidového řetězce označen fluorescenčními barvivy, z nichž každé vyzařuje světlo v různých vlnových délkách.

Díky své větší účelnosti a rychlosti je dnes sekvenování pomocí barviva-terminátoru hlavní oporou automatizovaného sekvenování. Mezi jeho omezení patří účinky barviva v důsledku rozdílů ve včlenění terminátorů řetězce značených barvivem do fragmentu DNA, což vede k nestejným výškám a tvarům píků v chromatogramu stopy sekvence elektronické DNA po kapilární elektroforéze (viz obrázek vlevo).

Tento problém byl vyřešen použitím modifikovaných DNA polymerázových enzymatických systémů a barviv, které minimalizují variabilitu inkorporace, a také metodami pro eliminaci „skvrn od barviva“. Metoda sekvenování pomocí barviva a terminátoru spolu s automatizovanými vysoce výkonnými analyzátory sekvencí DNA se nyní používá pro drtivou většinu sekvenovacích projektů.

Mezi časté problémy sekvenování DNA patří špatná kvalita prvních 15-40 bází sekvence a zhoršující se kvalita sekvenovacích stop po 700-900 bázích. Software pro volání bází obvykle udává odhad kvality, který napomáhá kvalitnímu ořezávání.

V případech, kdy jsou fragmenty DNA klonovány před sekvenováním, může výsledná sekvence obsahovat části klonovacího vektoru. Naproti tomu klonování založené na PCR a nově vznikající sekvenční technologie založené na pyrosequencingu se často vyhýbají použití klonovacích vektorů. V poslední době byly vyvinuty jednokrokové Sangerovy sekvenovací (kombinovaná amplifikace a sekvenování) metody jako Ampliseq a SeqSharp, které umožňují rychlé sekvenování cílových genů bez klonování nebo předchozí amplifikace.

Současné metody mohou přímo sekvenovat pouze relativně krátké (300-1000 nukleotidů dlouhé) fragmenty DNA v jedné reakci. Hlavní překážkou sekvenování fragmentů DNA nad tento velikostní limit je nedostatečná schopnost separace pro řešení velkých fragmentů DNA, které se liší délkou pouze o jeden nukleotid. Ve všech případech je nezbytné použít primer s volným 3′ koncem.[citace nutná]

Automatizace a příprava vzorků

Pohled na začátek ukázkového čtení dye-terminátoru (klikněte pro rozbalení)

Přístroje pro automatizované sekvenování DNA (sekvencery DNA) mohou sekvenovat až 384 vzorků DNA v jedné dávce (běhu) až za 24 běhů denně. Sekvencery DNA provádějí kapilární elektroforézu pro oddělení velikosti, detekci a záznam fluorescence barviva a výstupy dat jako fluorescenční špičkové stopové chromatogramy. Sekvenovací reakce termocyklizací, vyčištěním a resuspenzí v pufrovém roztoku před naložením do sekvenceru se provádějí samostatně. Řada komerčních i nekomerčních softwarových balíčků může ořezávat nekvalitní stopy DNA automaticky. Tyto programy skórují kvalitu každého vrcholu a odstraňují nekvalitní bázové vrcholy (obvykle umístěné na koncích sekvence). Přesnost takových algoritmů je nižší než vizuální vyšetření lidským operátorem, ale dostačující pro automatizované zpracování velkých sekvenčních datových souborů.

Amplifikace a klonální selekce

Genomická DNA je roztříštěna na náhodné kousky a naklonována jako bakteriální knihovna. DNA z jednotlivých bakteriálních klonů je sekvenována a sekvence je sestavena pomocí překrývajících se oblastí DNA.(klikněte pro rozbalení)

Cílem rozsáhlého sekvenování je často sekvenování velmi dlouhých kusů DNA, například celých chromozomů, i když rozsáhlé sekvenování může být také použito pro generování velmi velkého množství krátkých sekvencí, jaké se vyskytují například v fágovém zobrazení. U delších cílů, jako jsou chromozomy, se běžné přístupy skládají z řezání (s restrikčními enzymy) nebo stříhání (mechanickými silami) velkých fragmentů DNA do kratších fragmentů DNA. Fragmentovaná DNA je naklonována do vektoru DNA a amplifikována v Escherichia coli. Krátké fragmenty DNA vyčištěné z jednotlivých bakteriálních kolonií jsou jednotlivě sekvenovány a elektronicky sestaveny do jedné dlouhé, souvislé sekvence.

Tato metoda nevyžaduje žádné již existující informace o sekvenci DNA a je označována jako de novo sekvenování. Mezery v sestavené sekvenci mohou být vyplněny primerovou chůzí. Různé strategie mají různé kompromisy v rychlosti a přesnosti; brokovnicové metody jsou často používány pro sekvenování velkých genomů, ale jejich sestavení je složité a obtížné, zejména sekvenční opakování často způsobuje mezery v sestavení genomu.

Většina sekvenovacích přístupů využívá in vitro klonovací krok k amplifikaci jednotlivých molekul DNA, protože jejich metody molekulární detekce nejsou dostatečně citlivé na sekvenování jednotlivých molekul. Emulzní PCR izoluje jednotlivé molekuly DNA spolu s primerem potaženými kuličkami ve vodných kapičkách v olejové fázi. Polymerázová řetězová reakce (PCR) pak pokryje každou kuličku klonálními kopiemi molekuly DNA s následnou imobilizací pro pozdější sekvenování. Emulzní PCR používají v metodách Marguilis et al. (komercializováno 454 Life Sciences), Shendure a Porreca et al. (také známé jako „sekvenování Polony“) a sekvenování SOLiD, (vyvinuto Agencourt, nyní Applied Biosystems).

Doporučujeme:  Team building

Jinou metodou in vitro klonální amplifikace je bridge PCR, kdy jsou fragmenty amplifikovány na primerech připojených k pevnému povrchu, používaných v Illumina Genome Analyzeru. Výjimkou jsou jednomolekulové metody, jaké vyvinula laboratoř Stephena Quakea (později komercializovaná společností Helicos): využívá zářivé fluorofory a laserové excitace k detekci přírůstků bází z jednotlivých molekul DNA připevněných k povrchu, čímž eliminuje potřebu molekulární amplifikace.

Vysoce výkonné sekvenování

Vysoká poptávka po nenáročném sekvenování je hnací silou vývoje vysoce výkonných sekvenčních technologií, které paralelizují sekvenovací proces a produkují tisíce nebo miliony sekvencí najednou. Vysoce výkonné sekvenovací technologie mají snížit náklady na sekvenování DNA nad rámec toho, co je možné se standardními metodami terminátoru barviva.

Lynx Therapeutics‘ Massively Parallel Signature Sequencing (MPSS)

První sekvenční technologie „nové generace“, MPSS, byla vyvinuta v 90. letech v Lynx Therapeutics, společnosti založené v roce 1992 Sydney Brennerem a Samem Eletrem. MPSS byla metoda založená na kuličkách, která používala složitý přístup ligace adaptéru následovaný dekódováním adaptéru, čtení sekvence v přírůstcích čtyř nukleotidů; tato metoda ji činila náchylnou k sekvenčnímu specifickému zkreslení nebo ztrátě specifických sekvencí. Protože tato technologie byla tak složitá, MPSS byla prováděna pouze „in-house“ společností Lynx Therapeutics a žádné stroje se neprodávaly; když spojení se společností Solexa později vedlo k vývoji sekvencování-by-synthesis, jednoduššího přístupu s četnými výhodami, MPSS se stala zastaralou. Nicméně základní vlastnosti MPSS výstupu byly typické pro pozdější datové typy „next-gen“, včetně stovek tisíc krátkých sekvencí DNA. V případě MPSS byly typicky používány pro sekvencování cDNA pro měření hladin genové exprese. Lynx Therapeutics se v roce 2004 sloučila se společností Solexa a tuto společnost později koupila společnost Illumina.

Polonyho sekvenování, vyvinuté v laboratoři George Churche na Harvardu, patřilo v roce 2005 mezi první sekvenovací systémy nové generace používané k sekvenování celého genomu. Kombinovalo knihovnu in vitro párových značek s emulzí PCR, automatizovaným mikroskopem a sekvenovací chemií založenou na ligacích, aby sekvenovalo genom E. coli s přesností > 99,9999% a náklady přibližně 1/10 Sangerova sekvenování. Technologie byla licencována společnosti Agencourt Biosciences, následně se rozvinula do Agencourt Personal Genomics a nakonec byla začleněna do platformy Applied Biosystems SOLiD.

Paralelizovanou verzi pyrosequencingu vyvinula společnost 454 Life Sciences, kterou od té doby získala společnost Roche Diagnostics. Metoda zesiluje DNA uvnitř kapiček vody v olejovém roztoku (emulze PCR), přičemž každá kapička obsahuje jednu šablonu DNA připojenou k jedné primerem potažené kuličce, která pak tvoří klonální kolonii. Sekvenovací stroj obsahuje mnoho studní o objemu pikoliru, z nichž každá obsahuje jednu kuličku a sekvenční enzymy. Pyrosequencing využívá luciferázu k generování světla pro detekci jednotlivých nukleotidů přidaných do rodící se DNA a kombinovaná data se používají k generování sekvenčních odečtů. Tato technologie poskytuje střední délku odečtu a cenu za bázi ve srovnání se Sangerovým sekvenováním na jednom konci a Solexa a SOLiD na druhém.

Sekvenování Illumina (Solexa)

Solexa, nyní součást Illuminy, vyvinula sekvenční technologii založenou na reverzibilních terminátorech barviv. Molekuly DNA jsou nejprve připojeny k primerům na sklíčku a zesíleny tak, aby vznikly lokální klonální kolonie (bridžová amplifikace). Přidávají se čtyři typy ddNTP a odplavují se neimponované nukleotidy. Na rozdíl od pyrosequencingu může být DNA rozšířena vždy jen o jeden nukleotid. Kamera pořizuje snímky fluorescenčně označených nukleotidů, poté je barvivo spolu s terminálním 3′ blokátorem chemicky odstraněno z DNA, což umožňuje další cyklus.

Technologie SOLiD od Applied Biosystems využívá sekvenování ligací. Zde je zásoba všech možných oligonukleotidů o pevné délce označena podle sekvenované pozice. Oligonukleotidy jsou žíhány a podvázány; preferenční ligace DNA ligázou pro shodné sekvence má za následek signál informující o nukleotidu v této pozici. Před sekvenováním je DNA amplifikována emulzí PCR. Výsledná kulička, z níž každá obsahuje pouze kopie stejné molekuly DNA, je uložena na skleněném sklíčku. Výsledkem jsou sekvence veličin a délek srovnatelné se sekvenováním Illumina.

Sekvenování iontových polovodičů

Ion Torrent Systems Inc. vyvinula systém založený na použití standardní sekvenční chemie, ale s novým, polovodičovým detekčním systémem. Tato metoda sekvenování je založena na detekci vodíkových iontů, které se uvolňují během polymerizace DNA, na rozdíl od optických metod používaných v jiných sekvenovacích systémech. Mikrostudna obsahující vzorový řetězec DNA, který má být sekvenován, je zaplavena jediným typem nukleotidu. Pokud je zavedený nukleotid komplementární k vedoucímu vzorovému nukleotidu, je začleněn do rostoucího komplementárního řetězce. To způsobí uvolnění vodíkového iontu, který spustí senzor přecitlivělých iontů, což signalizuje, že došlo k reakci. Pokud jsou v sekvenci vzoru přítomny homopolymerní opakování, bude do jednoho cyklu začleněno více nukleotidů. To vede k odpovídajícímu počtu uvolněných vodíků a úměrně vyššímu elektronickému signálu.

DNA nanoball sequencing je typ vysoce výkonné sekvenční technologie, která se používá k určení celé genomové sekvence organismu. Společnost Complete Genomics používá tuto technologii k sekvencování vzorků, které výzkumníci předkládají z několika projektů. Metoda využívá replikaci v kruhu pro amplifikaci malých fragmentů genomové DNA do DNA nanokuliček. K určení nukleotidové sekvence se pak používá nespoutané sekvencování ligací. Tato metoda sekvencování DNA umožňuje sekvenovat velké množství DNA nanokuliček za jeden běh a za nízké náklady na činidlo ve srovnání s jinými sekvenačními platformami nové generace. Z každé DNA nanokuličky se však určují pouze krátké sekvence DNA, což znesnadňuje mapování krátkých sekvencí do referenčního genomu. Tato technologie byla použita pro více projektů sekvencování genomu a je naplánováno, že bude použita pro další.

Doporučujeme:  Informační entropie

Helioskop(TM) sekvenování jedné molekuly

Na základě technologie „true single molecule sequencing“ využívá Helioscope sekvenování fragmentů DNA s přidanými polyA koncovými adaptéry, které jsou připojeny k povrchu průtokové buňky. Další kroky zahrnují extenzivní sekvenování s cyklickými promytími průtokové buňky s fluorescenčně značenými nukleotidy (vždy jeden typ nukleotidu, stejně jako u Sangerovy metody). Čtení provádí Helioscope sekvencer. Čtení jsou krátká, až 55 bází za běh, ale nedávné vylepšení metodiky umožňuje přesnější čtení homopolymerů (úseky jednoho typu nukleotidů) a sekvenování RNA.

Sekvenování jedné molekuly SMRT(TM)

Sekvenování SMRT je založeno na sekvenování metodou syntézy. DNA je syntetizována v tzv. zero-mode wave-guides (ZMW) – malých nádobách podobných studni, kde jsou zachytávací nástroje umístěny na dně studny. Sekvenování se provádí za použití nemodifikované polymerázy (připojené ke dnu ZMW) a fluorescenčně značených nukleotidů volně proudících v roztoku. Studny jsou konstruovány tak, že je detekována pouze fluorescence vyskytující se na dně studny. Fluorescenční štítek je oddělen od nukleotidu při jeho začlenění do řetězce DNA, přičemž zůstává nemodifikovaný řetězec DNA. Podle Pacific Biosciences, vývojáře technologie SMTR, tato metodika umožňuje detekci nukleotidových modifikací (např. metylace ad cytosin). Dochází k tomu pozorováním kinetiky polymerázy. Tento přístup umožňuje čtení 1000 nukleotidů.

Sekvenování jedné molekuly v reálném čase (RNAP)

Tato metoda je založena na RNA polymeráze (RNAP), která je navázána na polystyrenovou kuličku, přičemž distální konec sekvenované DNA je navázán na jinou kuličku, přičemž obě kuličky jsou umístěny v optických lapačích. Pohyb RNAP během transkripce přibližuje kuličky a jejich relativní změny vzdálenosti, které pak mohou být zaznamenány v jediném nukleotidovém rozlišení. Sekvence je odvozena na základě čtyř odečtů se sníženou koncentrací každého ze čtyř typů nukleotidů (podobně jako Sangersova metoda).

Tato metoda je založena na odečtu elektrického signálu, který se vyskytuje na bázi nukleotidů alfa-hemolysinovými póry kovalentně vázanými na cyklodextrin. DNA procházející nanopóry mění svůj iontový proud. Tato změna je závislá na tvaru, velikosti a délce sekvence DNA. Každý typ nukleotidu blokuje iontový tok póry po různou dobu. Metoda má potenciál vývoje, protože nevyžaduje modifikované nukleotidy, nicméně rozlišení jednotlivých nukleotidů zatím není k dispozici.

Přístup VisiGen Biotechnologies

Společnost VisiGen Biotechnologies představila speciálně upravenou DNA polymerázu pro použití při jejich sekvenování. Tato polymeráza působí jako senzor – včlenila do svého aktivního centra dárcovské fluorescenční barvivo. Toto dárcovské barvivo působí FRET (fluorescenční rezonanční přenos energie), čímž indukuje fluorescenci různě označených nukleotidů. Tento přístup umožňuje odečty prováděné při speadu, při kterém polymeráza včlení nukleotidy do sekvence (několik stovek za sekundu). Nukleotidový fluorochrom se uvolní po včlenění do řetězce DNA. Očekávaná délka odečtů by při tomto přístupu měla dosáhnout 1000 nukleotidů, nicméně to bude muset být potvrzeno.

Sekvenování hybridizací je neenzymatická metoda, která používá DNA mikropole. Jednotlivá skupina DNA, jejíž sekvence má být určena, je fluorescenčně označena a hybridizována do skupiny obsahující známé sekvence. Silné hybridizační signály z daného místa na poli identifikují její sekvenci v sekvenované DNA. Hmotnostní spektrometrii lze použít ke stanovení hmotnostních rozdílů mezi fragmenty DNA vzniklými při reakcích na ukončení řetězce.

Metody sekvenování DNA, které se v současnosti vyvíjejí, zahrnují značení DNA polymerázy, čtení sekvence při průchodu řetězce DNA nanopóry a techniky založené na mikroskopii, jako je AFM nebo transmisní elektronová mikroskopie, které se používají k identifikaci pozic jednotlivých nukleotidů v rámci dlouhých fragmentů DNA (>5 000 bp) značením nukleotidů těžšími prvky (např. halogeny) pro vizuální detekci a záznam.
Technologie třetí generace mají za cíl zvýšit propustnost a snížit čas k výsledku a náklady tím, že odstraní potřebu nadměrných činidel a využijí procesivitu DNA polymerázy.

V mikrofluidním Sangerově sekvenování se celá termocyklační amplifikace DNA fragmentů i jejich separace elektroforézou provádí na jedné skleněné destičce (o průměru přibližně 10 cm), čímž se snižuje použití činidla i náklady.[citace nutná] V některých případech výzkumníci ukázali, že mohou zvýšit propustnost konvenčního sekvenování pomocí mikročipů. Bude ještě třeba provést výzkum, aby bylo toto využití technologie efektivní.

V říjnu 2006 založila nadace X Prize Foundation iniciativu na podporu vývoje technologií sekvenování celého genomu, nazvanou Archon X Prize, s úmyslem udělit 10 milionů dolarů „prvnímu týmu, který dokáže sestrojit zařízení a použít ho k sekvenování 100 lidských genomů do 10 dnů nebo méně, s přesností nejvýše jedné chyby v každých 100 000 sekvenovaných bází, přičemž sekvence přesně pokrývají nejméně 98% genomu, a s opakovanými náklady nejvýše 10 000 dolarů (US) za genom“.

Každý rok NHGRI podporuje granty pro nový výzkum a vývoj v genomice. Granty pro rok 2010 a kandidáti pro rok 2011 zahrnují pokračující práci v metodikách mikrofluidiky, polonie a base-heavy sekvenování

Hlavní mezníky v sekvenování DNA