Aktivní místo enzymu je vazebné místo, kde dochází ke katalýze. Struktura a chemické vlastnosti aktivního místa umožňují rozpoznání a navázání substrátu.
Aktivním místem je obvykle malá kapsa na povrchu enzymu, která obsahuje rezidua zodpovědná za susbtratovou specificitu (náboj, hydrofobnost, sterická překážka) a katalytická rezidua, která často působí jako dárci nebo akceptory protonů nebo jsou zodpovědná za vazbu kofaktoru, jako je Pyridoxal, Thiamin nebo NAD.
Hlavní článek – Viz Enzymová katalýza
Aktivní místo je také místem inhibice enzymů (viz článek Enzymový inhibitor).
Existuje několik modelů, jak enzymy fungují: model zámku a klíče a indukovaný fit model. Substráty se vážou na aktivní místo enzymu nebo specifickou kapsu prostřednictvím vodíkových vazeb, hydrofobních interakcí, dočasné kovalentní vazby nebo kombinací všech těchto vazeb. Zbytky aktivního místa budou působit jako dárci nebo akceptory protonů nebo jiných skupin na substrátu, aby usnadnily reakci. Jinými slovy, aktivní místo upravuje reakční mechanismus s cílem snížit aktivační energii reakce. Produkt je obvykle nestabilní v aktivním místě kvůli sterickým překážkám, které ho nutí k uvolnění a navrácení enzymu do původního stavu.