„Proudová svorka“ je běžná technika v elektrofyziologii. Jedná se o záznam proudové svorky v celé buňce o výboji neuronu v důsledku jeho depolarizace proudovou injekcí
Elektrofyziologie je studium elektrických vlastností biologických buněk a tkání. Zahrnuje měření změny napětí nebo proudu elektrického proudu na široké škále škál od proteinů jednoho iontového kanálu až po celé tkáně, jako je srdce. V neurovědě zahrnuje měření elektrické aktivity neuronů a zejména aktivity akčního potenciálu.
Klasické elektrofyziologické techniky
Klasické elektrofyziologické techniky zahrnují umístění elektrod do různých přípravků biologické tkáně. Hlavními typy elektrod jsou: 1) jednoduché pevné vodiče, jako jsou disky a jehly (singly nebo pole), 2) obrysy na deskách tištěných spojů a 3) duté trubice naplněné elektrolytem, jako jsou skleněné pippety. Mezi hlavní přípravky patří 1) živé organismy, 2) odstraněná tkáň (akutní nebo kultivovaná), 3) oddělené buňky z odstraněné tkáně (akutní nebo kultivované), 4) uměle vypěstované buňky nebo tkáně nebo 5) hybridy výše uvedených.
Je-li elektroda dostatečně malá (mikrometry) v průměru, může se elektrofyziolog rozhodnout vložit špičku do jedné buňky. Taková konfigurace umožňuje přímé pozorování a záznam intracelulární elektrické aktivity jedné buňky. Zároveň však taková invazivní konfigurace zkracuje životnost buňky. Intracelulární aktivitu lze pozorovat také pomocí speciálně vytvořené (duté) skleněné pipety. Při této technice je špička mikroskopické pipety přitisknuta k buněčné membráně, ke které pevně přilne. Elektrolyt v pipetě může být přiveden do kontinuity tekutiny s cytoplazmou tak, že se elektrolytu dodá tlakový impuls, aby se protrhla malá náplast membrány obehnaná okrajem pipety (záznam celé buňky). Případně může být iontová kontinuita vytvořena „perforací“ náplasti tak, že se exogenní iontové kanály uvnitř elektrolytu vloží do membránové náplasti (záznam perforované náplasti). Nakonec může být náplast ponechána neporušená (záznam náplasti).
Elektrofyziolog se může rozhodnout nevkládat špičku do jednoho článku. Místo toho může být špička elektrody ponechána v kontinuitě s extracelulárním prostorem. Je-li špička dostatečně malá, může taková konfigurace umožnit nepřímé pozorování a záznam elektrické aktivity jednoho článku a nazývá se záznam jedné jednotky. V závislosti na přípravě a přesném umístění může extracelulární konfigurace zachytit aktivitu několika blízkých článků současně, a to se nazývá záznam více jednotek.
Jak se zvětšuje velikost elektrod, snižuje se rozlišovací schopnost. Větší elektrody jsou citlivé pouze na čistou aktivitu mnoha buněk, nazývaných lokální polní potenciály. Ještě větší elektrody, jako jsou neizolované jehly a povrchové elektrody používané klinickými a chirurgickými neurofyziology, jsou citlivé pouze na určité typy synchronní aktivity v populacích buněk čítajících miliony.
Další klasické elektrofyziologické techniky zahrnují jednokanálový záznam a amperometrii.
Optické elektrofyziologické techniky
Optické elektrofyziologické techniky byly vytvořeny vědci a inženýry, aby překonaly jedno z hlavních omezení klasických technik. Klasické techniky umožňují pozorování elektrické aktivity v přibližně jednom bodě v rámci objemu tkáně. Klasické techniky v podstatě singularizují distribuovaný jev. Zájem o prostorové rozložení bioelektrické aktivity podnítil vývoj molekul schopných vyzařovat světlo v reakci na jejich elektrické nebo chemické prostředí. Příkladem jsou barviva citlivá na napětí a fluoreskující proteiny.
Po zavedení jedné nebo více takových sloučenin do tkáně perfuzí, injekcí nebo genovou expresí lze pozorovat a zaznamenávat 1 nebo 2rozměrné rozložení elektrické aktivity.
Intracelulární záznam zahrnuje měření napětí a/nebo proudu přes membránu buňky. Pro provedení intracelulárního záznamu musí být špička jemné (ostré) mikroelektrody vložena dovnitř buňky, aby bylo možné změřit membránový potenciál. Typicky klidový membránový potenciál zdravé buňky bude -60 až -80 mV a během akčního potenciálu může membránový potenciál dosáhnout +40 mV.
V roce 1963 získali Alan Lloyd Hodgkin a Andrew Fielding Huxley Nobelovu cenu za fyziologii nebo medicínu za jejich přínos k pochopení mechanismů vzniku akčních potenciálů v neuronech. Jejich experimenty zahrnovaly intracelulární záznamy z obřího axonu olihně atlantské (Loligo pealei) a patřily mezi první aplikace techniky „napěťové svorky“.
Dnes je většina mikroelektrod používaných pro intracelulární záznam skleněnými mikropipetami s průměrem špičky < 1 mikrometr a odporem několika megaohmů. Mikropipety jsou naplněny roztokem, který má podobné iontové složení jako intracelulární tekutina buňky. Chlorovaný stříbrný drát vložený do trubky spojuje elektrolyt elektricky se zesilovačem a obvodem pro zpracování signálu. Napětí měřené elektrodou se porovnává s napětím referenční elektrody, obvykle stříbro-stříbrného chloridového drátu v kontaktu s extracelulární tekutinou kolem buňky. Obecně platí, že čím menší hrot elektrody, tím vyšší je její elektrický odpor, takže elektroda je kompromisem mezi velikostí (dostatečně malou na to, aby pronikla do jedné buňky s minimálním poškozením buňky) a odporem (dostatečně nízkou na to, aby bylo možné rozeznat malé neuronální signály z tepelného šumu ve hrotu elektrody).
Napěťová svorka využívá mechanismus negativní zpětné vazby. Membránový zesilovač potenciálu měří membránové napětí a vysílá výstup do zesilovače zpětné vazby. Zesilovač zpětné vazby odečítá membránové napětí od povelového napětí, které přijímá od generátoru signálu. Tento signál je zesílen a přes záznamovou elektrodu je vrácen do buňky.
Technika napěťové svorky umožňuje experimentátorovi „svorkovat“ buněčný potenciál na zvolenou hodnotu. To umožňuje měřit, kolik iontového proudu protíná membránu buňky při jakémkoliv daném napětí. To je důležité, protože mnoho iontových kanálů v membráně neuronu jsou napěťově řízené iontové kanály, které se otevírají pouze tehdy, je-li napětí membrány v určitém rozsahu. Měření proudu napěťovou svorkou je umožněno téměř současným digitálním odčítáním přechodných kapacitních proudů, které procházejí jako záznamová elektroda a buněčná membrána jsou nabity, aby změnily potenciál buňky. (Viz hlavní článek o napěťové svorce.)
Technika proudové svorky zaznamenává membránový potenciál vstřikováním proudu do buňky přes záznamovou elektrodu. Na rozdíl od módu napěťové svorky, kde je membránový potenciál udržován na úrovni určené experimentátorem, v módu „proudové svorky“ se membránový potenciál může volně měnit a zesilovač zaznamenává jakékoliv napětí, které buňka generuje sama nebo v důsledku stimulace. Tato technika se používá ke studiu toho, jak buňka reaguje, když elektrický proud vstoupí do buňky; to je důležité například pro pochopení toho, jak neurony reagují na neurotransmitery, které působí otevřením membránových iontových kanálů.
Svorka patch připojená k buňce používá mikropipetu připojenou k buněčné membráně, která umožňuje záznam z jednoho iontového kanálu.
Tuto techniku vyvinuli Erwin Neher a Bert Sakmann, kteří v roce 1991 obdrželi Nobelovu cenu. Konvenční intracelulární záznam zahrnuje napíchnutí buňky jemnou elektrodou; záznam patch-clamp používá jiný přístup. Patch-clamp mikroelektroda je mikropipeta s poměrně velkým průměrem špičky. Mikrokosmička je umístěna vedle buňky a jemným odsáváním se přes mikroelektrodu přitáhne kus buněčné membrány („patch“) do špičky mikroelektrody; skleněná špička tvoří s buněčnou membránou vysoce odolné ‚těsnění‘. Tato konfigurace je režim „připojený k buňce“ a může být použit pro studium aktivity iontových kanálů, které jsou přítomny v patche membrány.
Pokud se nyní použije větší odsávání, může být malá patch membrány ve špičce elektrody vytlačena, takže elektroda zůstane utěsněna ke zbytku buňky. Tento „celobuněčný“ režim umožňuje velmi stabilní intracelulární záznam. Nevýhodou (ve srovnání s běžným intracelulárním záznamem s ostrými elektrodami) je, že intracelulární tekutina buňky se mísí s roztokem uvnitř záznamové elektrody, a tak mohou být některé důležité složky intracelulární tekutiny zředěny. Varianta této techniky, technika „perforované náplasti“, se snaží tyto problémy minimalizovat.
Místo odsávání k vytlačení membránové náplasti ze špičky elektrody je také možné vyjmout elektrodu z buňky a odtáhnout tak náplast membrány od zbytku buňky. Tento přístup umožňuje farmakologickou analýzu vlastností membrány náplasti.
V situacích, kdy člověk chce zaznamenat potenciál uvnitř buněčné membrány s minimálním účinkem na iontovou konstituci intracelulární tekutiny, lze použít ostrou elektrodu. Tyto mikropipety (elektrody) jsou opět jako ty pro patch clamp vytažené ze skleněných kapilár, ale pór je mnohem menší, takže dochází k velmi malé iontové výměně mezi intracelulární tekutinou a elektrlolytem v pipetě. Odpor elektrody v 10s nebo 100s MΩ v tomto případě. Často je špička elektrody vyplněna různými druhy barviv, jako je Luciferova žluť, aby vyplnila zaznamenané buňky, pro pozdější potvrzení jejich morfologie pod mikroskopem. Barviva se vstřikují nanesením kladného nebo záporného, stejnosměrného nebo pulzního napětí na elektrody v závislosti na polaritě barviva.
Elektroda zavedená do mozku živého zvířete detekuje elektrickou aktivitu, která je generována neurony přiléhajícími ke špičce elektrody. Pokud je elektroda mikroelektroda s velikostí špičky okolo 1 mikrometru, elektroda obvykle detekuje aktivitu maximálně jednoho neuronu. Zaznamenávání tímto způsobem se obecně nazývá záznam „jedné jednotky“. Zaznamenané akční potenciály jsou velmi podobné akčním potenciálům, které jsou zaznamenávány intracelulárně, ale signály jsou velmi mnohem menší (typicky okolo 1 mV). Tímto způsobem je pořizována většina záznamů aktivity jednotlivých neuronů u zvířat v anestezii a všechny záznamy jednotlivých neuronů u zvířat při vědomí. Záznamy jednotlivých neuronů u živých zvířat poskytly důležité poznatky o tom, jak mozek zpracovává informace. Například David Hubel a Torsten Wiesel zaznamenali aktivitu jednotlivých neuronů v primární zrakové kůře kočky v anestezii a ukázali, jak jednotlivé neurony v této oblasti reagují na velmi specifické rysy zrakového podnětu. Hubel a Wiesel získali v roce 1981 Nobelovu cenu za fyziologii nebo medicínu.
Pokud je hrot elektrody o něco větší, pak by elektroda mohla zaznamenat aktivitu generovanou několika neurony. Tento typ záznamu se často nazývá „záznam o více jednotkách“ a často se používá u zvířat při vědomí k zaznamenání změn aktivity v diskrétní mozkové oblasti během normální aktivity. Záznamy z jedné nebo více takových elektrod, které jsou v těsném rozestupu, mohou být použity k identifikaci počtu buněk kolem ní a také toho, které z hrotů pocházejí z které buňky. Tento proces se nazývá třídění hrotů a je vhodný v oblastech, kde jsou identifikovány typy buněk s přesně definovanými charakteristikami hrotů.
Pokud je hrot elektrody ještě větší, obecně nelze rozlišit aktivitu jednotlivých neuronů, ale elektroda bude stále schopna zaznamenat potenciál pole generovaný aktivitou mnoha buněk.
Schématický diagram znázorňující záznam potenciálu pole z hipokampu potkana. Vlevo je schematický diagram presynaptického terminálu a postsynaptického neuronu. Ten má znázorňovat velkou populaci synapsí a neuronů. Když synapse uvolní glutamát do postsynaptické buňky, otevře ionotropní kanály pro glutamátové receptory. Čistý tok proudu je dovnitř, takže je generována jímka proudu. Nedaleká elektroda (#2) to detekuje jako negativitu. Intracelulární elektroda umístěná uvnitř buněčného těla (#1) zaznamenává změnu membránového potenciálu, kterou příchozí proud způsobuje.
Amperometrie využívá uhlíkovou elektrodu k zaznamenávání změn v chemickém složení oxidovaných složek biologického roztoku. Oxidace a redukce se provádí změnou napětí na aktivním povrchu záznamové elektrody v procesu známém jako „skenování“. Protože některé chemické látky v mozku ztrácejí nebo získávají elektrony při charakteristickém napětí, lze identifikovat jednotlivé druhy. Amperometrie se používá ke studiu exocytózy v nervovém a endokrinním systému. Mnoho monoaminových neurotransmiterů, např. noradrenalin (noradrenalin), dopamin, serotonin (5-HT), je oxidovatelných. Metodu lze také použít s buňkami, které nevylučují oxidovatelné neurotransmitery tím, že je „zatěžují“ 5-HT nebo dopaminem.
Planární patch clamp je nová metoda vyvinutá pro vysoce výkonnou elektrofyziologii.
Místo umístění pipety na přilnavou buňku je buněčná suspenze pipetována na čipu obsahujícím mikrostrukturovanou clonu.
Schematický nákres konfigurace klasické svorky náplasti. Pipeta náplasti je přemístěna do buňky pomocí mikromanipulátoru pod optickou kontrolou. Je třeba se vyvarovat relativních pohybů mezi pipetou a buňkou, aby spojení buňky s pipetou zůstalo neporušené.
Při planární konfiguraci náplasti je buňka umístěna odsáváním – po utěsnění lze pak vyloučit relativní pohyby mezi buňkou a aperturou. Antivibrační tabulka není nutná.
Jednotlivá buňka je pak umístěna na otvoru odsáváním a vytvoří se těsné spojení (Gigaseal).
Plošná geometrie nabízí ve srovnání s klasickým experimentem celou řadu výhod:
– umožňuje integraci mikrofluidik, což umožňuje automatickou složenou aplikaci pro screening iontových kanálů.
– systém je přístupný pro techniky optické nebo skenovací sondy
– lze provést perfuzi intracelulární strany.