Zatímco buněčné a molekulární mechanismy učení a paměti byly dlouho ústředním tématem neurověd, teprve v posledních letech se pozornost obrátila k epigenetickým mechanismům, které stojí za dynamickými změnami v genové transkripci zodpovědnými za tvorbu a udržování paměti. Epigenetická genová regulace často zahrnuje fyzikální značení (chemickou modifikaci) DNA nebo přidružených proteinů, které způsobuje nebo umožňuje dlouhotrvající změny v genové aktivitě. Epigenetické mechanismy, jako je metylace DNA a modifikace histonu (metylace, acetylace a deacetylace), hrají důležitou roli v učení a paměti.
Metylace DNA zahrnuje přidání methylové skupiny do 5′ cytosinového zbytku. K tomu obvykle dochází u cytosinů, které tvoří součást cytosin-guanindinukleotidu (CpG místa). Metylace může vést k aktivaci nebo potlačení transkripce genů a je zprostředkována aktivitou DNA methyltransferáz (DNMT). DNMT3A a DNMT3B regulují de novo metylaci CpG míst, zatímco DNMT1 udržuje zavedené metylační vzorce. S-adenosyl methionin působí jako dárce methylu.
Současná hypotéza o tom, jak metylace DNA přispívá k ukládání vzpomínek, je, že dynamické změny metylace DNA probíhají dočasně, aby se aktivovala transkripce genů, které kódují proteiny, jejichž úlohou je stabilizovat paměť.
Miller a Sweatt prokázali, že potkani vycvičení v kontextuálním paradigmatu podmiňování se strachem měli zvýšené hladiny mRNA pro DNMT3a a DNMT3b v hipokampu. Podávání strachu je asociativní paměťový úkol, kdy je kontext, podobně jako místnost, spárován s averzivním podnětem, jako je šok nohou; zvířata, která se asociaci naučila, vykazují vyšší úrovně mrazivého chování, jsou-li vystavena kontextu i bez averzivní stimulace. Nicméně, když byli potkani bezprostředně po podmiňování se strachem ošetřeni inhibitory DNMT zebularinem nebo 5-aza-2′-deoxycytidinem, vykazovali sníženou schopnost učení (mrazivé chování). Když byli ošetření potkani znovu vycvičeni o 24 hodin později, podávali stejné výkony jako neléčení potkani. Dále bylo prokázáno, že když byly tyto inhibitory DNMT podány 6 hodin po procvičení a potkani byli testováni o 24 hodin později, vykazovali potkani normální paměť strachu, což naznačuje, že DNMT se podílejí specificky na konsolidaci paměti. Tato zjištění odhalují význam dynamických změn stavu metylace při tvorbě paměti.
Feng a kol. vytvořili dvojité podmíněné knockoutové (DKO) myši pro geny DNMT3a a DNMT1. Bylo prokázáno, že tyto myši mají významně oslabenou dlouhodobou potenciaci (LTP) a mnohem snadněji stimulovatelnou dlouhodobou depresi (LTD) v hipokampu. Při testování v Morrisově úloze vodní navigace, která se používá ke studiu prostorové paměti závislé na hipokampu, trvalo myším DNMT3a/DNMT1 DKO nalezení platformy déle než kontrolním myším. Jednotlivé knockoutové myši (SKO) pro DNMT3a nebo DNMT1 fungovaly normálně. Myši DKO také nebyly schopny konsolidovat paměť po podmiňování strachem. Vzhledem k tomu, že myši SKO nevykazovaly stejné poruchy učení a paměti jako myši DKO, byl učiněn závěr, že DNMT3a a DNMT1 hrají nadbytečné role v regulaci učení a paměti.
Když jsou DNMT inhibovány v prefrontální mozkové kůře, je narušeno vybavování stávajících vzpomínek, ale ne tvorba nových. To naznačuje, že metylace DNA může být obvodově specifická, pokud jde o regulaci tvorby a udržování vzpomínek.
Bylo prokázáno, že gen potlačující paměť, protein fosfatáza 1 (PP1), má po kondicionování s kontextuálním strachem zvýšenou CpG ostrovní metylaci. To odpovídalo sníženým hladinám PP1 mRNA v hipokampu cvičených potkanů. Když byly DNMT inhibovány, zvýšená metylace v genu PP1 již nebyla pozorována. Tyto údaje naznačují, že během konsolidace paměti v asociativních úlohách učení se CpG metylace používá k inhibici exprese PP1, genu, který negativně inhibuje tvorbu paměti.
Zatímco metylace DNA je nezbytná k inhibici genů podílejících se na potlačení paměti, demetylace DNA je důležitá při aktivaci genů, jejichž exprese pozitivně koreluje s tvorbou paměti. Sweatt a Miller také ukázali, že gen reelin, který se podílí na dlouhodobé indukci potenciace, měl snížený profil metylace a zvýšenou hladinu reelinu v mRNA u potkanů podmíněných strachem oproti kontrolním. Bylo také prokázáno, že neurotrofický faktor odvozený od mozku (Brain-derived neurotrophic factor, BDNF), další důležitý gen v oblasti neuroplasticity, má sníženou metylaci a zvýšenou transkripci u zvířat, která prošla učením. I když tyto studie byly spojeny s hipokampem, nedávné důkazy také ukázaly zvýšenou demetylaci reelinu a BDNF ve střední prefrontální kůře (mPFC), což je oblast podílející se na poznávání a emocích.
Mechanismus této na zkušenosti závislé demethylační odpovědi není zcela objasněn, i když některé důkazy ukazují, že DNMT mohou být zapojeny i do tohoto procesu. Bylo také naznačeno, že členové rodiny GADD45, kteří opravují poškození DNA, mohou k tomuto demethylačnímu procesu přispět.
Methyl-Binding Domain Proteins (MBD)
U myší, které mají genetické poruchy CpG vázajícího proteinu 2 (MeCP2), bylo prokázáno, že mají významné problémy v paměti závislé na hipokampu a mají poškozenou hipokampální LTP.
Metylace a učení a poruchy paměti
Změny exprese genů spojené s posttraumatickou stresovou poruchou (PTSD), která je charakterizována narušeným vymíráním traumatické paměti, mohou být zprostředkovány metylací DNA.
U schizofreniků bylo prokázáno, že reelin je sníženě regulován prostřednictvím zvýšené metylace DNA v promotorových oblastech GABAergních interneuronů. Rovněž bylo prokázáno, že DNMT1 je v těchto buňkách regulován.
Metylace histonů může buď zvýšit nebo snížit transkripci genů v závislosti na tom, který histon je modifikován, na aminokyselině, která je modifikována, a na počtu přidaných methylových skupin. V případě metylace lysinu existují tři typy modifikací: monometylované, dimethylované nebo trimetylované lysiny. di- nebo trimetylace histonu H3 na lysinu 9 (H3K9) je spojována s transkripčně tichými oblastmi, zatímco di- nebo trimetylace histonu H3 na lysinu 4 (H3K4) je spojována s transkripčně aktivními geny.
Histon 3 Lysin 4 Trimethylace a formování paměti
Hipokampus je důležitou mozkovou oblastí při tvorbě paměti. Trimethylace H3K4 je spojena s aktivní transkripcí. V kontextuálních experimentech s podmiňováním strachu u potkanů bylo zjištěno, že hladiny trimethylace H3K4 se po podmiňování strachem zvyšují v hipokampu. V těchto experimentech Gupta a kol. byla zjištěna souvislost mezi změnami v histonové metylaci a aktivní genovou expresí během konsolidace asociativních vzpomínek. V téže studii bylo také zjištěno, že tyto histonové metylace jsou reverzibilní, protože hladiny trimethylace H3K4 se po 24 hodinách vrátily k bazálním hladinám. To naznačovalo, že po konsolidaci paměti dochází k aktivní demethylaci. Pro další zkoumání role methyltransferáz při tvorbě dlouhodobé paměti tato studie použila stejné testy podmiňování strachem u potkanů s deficitem Mll, H3K4 specifické methyltransferázy. U potkanů s heterozygotním mutantním genem Mll+/- se ve srovnání s normálními potkany s intaktním genem Mll výrazně snížila jejich schopnost vytvářet dlouhodobou paměť. Proto musí mít methyltransferázy H3K4, jako je Mll, zásadní roli při tvorbě dlouhodobé paměti v hipokampu.
Na tvorbě paměti se také podílí změna stavu methylace histonů v místě specifických genových promotorů, na rozdíl od pouhého genomu. Geny Zif268 a BDNF jsou kritické pro konsolidaci paměti. Trimethylace H3K4 se zvyšuje kolem obou promotorů Zif268 a BDNF po kontextuální podmiňování strachem, kdy jsou tyto geny transkripčně aktivní. To ukazuje, že v době konsolidace paměti je transkripce genů pro tvorbu paměti, jako jsou Zif268 a bdnf, regulována histonovou metylací.
Histon 3 Lysin 9 Dimethylace a formování paměti
S transkripčním umlčováním je spojena dimethylace histonu H3 lysinu 9. Komplex G9a/G9a-like protein (GLP) je methyltransferáza specifická pro tvorbu této modifikace. Jedna studie zkoumala roli G9a/GLP-zprostředkovaného transkripčního umlčování v hipokampu a entorhinální kůře (EC) během konsolidace paměti. Bylo zjištěno, že inhibice G9a/GLP v EC, ale ne v hipokampu, vede ke zvýšení tvorby dlouhodobé paměti. Inhibice G9a/GLP v entorhinální kůře navíc změnila dimethylaci histonu H3 lysinu 9 v oblasti Cornu Ammonis 1 hipokampu, což naznačuje význam tohoto komplexu při zprostředkování propojení mezi těmito dvěma mozkovými oblastmi. Komplex G9a/GLP proto hraje důležitou roli při metylaci histonu a tvorbě dlouhodobé paměti v hipokampu a EC.
Metylace histonu a další epigenetické modifikace
Metylační znaky histonu korelují také s dalšími epigenetickými modifikacemi, jako je deacetylace histonu a metylace DNA, v kontextu učení a paměti. Snížená deacetylace histonu koreluje se zvýšením dimethylace H3K9, což je modifikace spojená s transkripčním umlčováním. Proto mohou být inhibitory histondeacetylázy aplikovány ke zvýšení acetylace histonu a potlačení dimethylace H3K9, čímž se zvýší transkripce genu. V případě metylace DNA bylo zjištěno, že zvýšení trimetylace H3K4 koreluje s pozměněnou metylací CpG míst u promotoru Zif268, genu podílejícího se na tvorbě paměti, po podmiňování strachem. Gupta a kol. ukázali, že metylace DNA u promotoru Zif268 se zvýšila po podmiňování strachem, což korelovalo se zvýšením exprese genu Zif268. Toto zjištění bylo překvapivé, protože se dříve předpokládalo, že metylace DNA vede k transkripčnímu umlčování.
Acetylace zahrnuje nahrazení vodíku acetylovou skupinou. V biologickém kontextu je acetylace nejčastěji spojována s modifikací bílkovin, konkrétně histonů. Acetylační reakce je nejčastěji katalyzována enzymy, které obsahují aktivitu histonacetyltransferázy (HAT).
Histonacetyltransferázy (HAT)
HAT jsou enzymy zodpovědné za acetylaci aminokyselin. HAT acetylát přeměnou lysinové postranní skupiny aminokyselin přidáním acetylové skupiny z acetylové CoA molekuly za vzniku acetyllysinu. HAT enzymy jsou nejčastěji spojovány s histonovými proteiny a pracují na regulaci interakce mezi histony a DNA, která je kolem nich obalena. HAT se neomezují pouze na acetylaci histonu, ale mohou acetylovat i mnoho dalších proteinů zapojených do manipulace s genovou expresí, jako je tomu u transkripčních faktorů a receptorových proteinů.
Acetylace je jedním z hlavních mechanismů zapojených do procesu remodelace chromatinu. remodelace chromatinu ovlivňuje regulaci genové exprese tím, že mění vztah mezi nukleozomy a DNA. Acetylace histonů odstraňuje pozitivní náboj, který snižuje úroveň interakce mezi dříve kladně nabitým histonem a negativně nabitými fosfátovými skupinami DNA obalenými kolem nukleozomového komplexu. Tato změna nábojů způsobuje uvolnění DNA z nukleozomu, tato uvolněná část má vyšší úroveň genové exprese než necacetylované oblasti.
Acetylace jako epigenetický marker
Acetlylace jako mechanismus učení a paměti
Role epigenetických mechanismů a remodelace chromatinu byla zapojena jak do synaptické plasticity, tak do genové exprese neuronů. Studie s inhibitory komplexu histondeaktylázy jako SAHA, toluen, garcinol, trichostatin A a butyrát sodný ukázaly, že acetylace je důležitá pro synaptickou plasticitu mozku; inhibicí komplexů deaktylázy se zvýšila celková míra acetylace v mozku, což vedlo ke zvýšené míře transkripce a lepší konsolidaci paměti. Použitím různých testů učení, jako je Morrisův test vodního bludiště a testy na podmiňování strachu ve spojení s léky ovlivňujícími acetylaci, bylo prokázáno, že acetylační vzorce v hipokampu jsou nedílnou součástí asociace paměti a učení. Studie s různými inhibitory HDAC a neurálním vývojem ukázaly zvýšené učení a paměť v důsledku zvýšeného stavu acetylace. Naopak studie provedené s inhibitory HAT přinesly zhoršení konsolidace paměti a celkový pokles učení.
Studie ukázaly, že ERK/MAPK kaskáda je důležitá pro regulaci lysinové acetylace v insulární kůře mozku (Část mozku podílející se na tvorbě chuťových vzpomínek). Aktivace ERK/MAPK kaskády byla pozorována u myší po zavedení nové chuti, kaskáda se ukázala jako nezbytná pro vytvoření paměti chuti. Navrhovaný mechanismus fungování této kaskády je, že MAPK reguluje histonovou acetylaci a následnou chromatinovou remodelaci pomocí následných efektorů, jako je vazebný protein CREB (který má aktivitu HAT). Pozorováním rychlosti acetylace v insulární kůře byli výzkumníci schopni určit, které vzorce acetylace byly způsobeny deacetylázovou nebo acetylázovou aktivitou a které byly výsledkem aktivity lysinové acetyltransferázy.
Dlouhodobá potenciace (LTP) je zvýšení síly signálu mezi neurony. LTP je základem synaptické plasticity a hraje stěžejní roli při tvorbě paměti. LTP je závislé na aktivitě NMDA receptorů v mozku a bylo prokázáno, že aktivita NMDA ovlivňuje acetylaci. Když jsou NMDA receptory aktivovány, způsobují příliv vápníku do buňky, který následně aktivuje různé signální dráhy, které nakonec aktivují ERK dráhu, která pak moduluje transkripční faktory jako CREB. CREB pak naverbuje HAT, který pomáhá vytvářet a stabilizovat dlouhodobou tvorbu paměti, často prostřednictvím vlastního zvěčnění acetylovaných histonů. Studie provedené na Acetylaci histonu H3 v CA1 oblasti hipokampu ukazují, že aktivace NMDA receptorů zvýšila acetylaci H3 a naopak inhibice ERK dráhy v CA1 oblasti měla za následek pokles acetylace H3. V souhrnu:
Role HDACů v CREBu: Transkripční aktivace závislá na CBP
Obrázek 1 Inhibice HDAC zvyšuje paměť a synaptickou plasticitu pomocí CREB:CBP. Obrázek převzat z Vecsey et al., (2007)
Histonové deacetylázy (HDAC) odstraňují z histonů acetylové skupiny (-COCH3), které mění struktury chromatinu a snižují dostupnost transkripčních faktorů k DNA, čímž snižují transkripci genů. Ukázalo se, že HDAC hrají roli v učení a paměti díky své regulaci v dráze CREB-CBP.
Studie dospěly k závěru, že inhibitory HDAC, jako je trichostatin A (TSA), zvyšují histonovou acetylaci a zlepšují synaptickou plasticitu a dlouhodobou paměť (obr. 1A). CREB, protein vázající prvky odpovědi cAMP a aktivátor transkripce, váže CBP tvořící komplex CREB: CBP. Tento komplex aktivuje geny podílející se na synaptické formaci a dlouhodobé paměti. (obr. 1B) Léčba TSA v hipokampální oblasti CA1 u myší zvýšila hladiny acetylace a zvýšila dlouhodobou potenciaci (LTP), mechanismus podílející se na učení a paměti (obr. 1B). Nicméně léčba TSA u CBP mutantů postrádajících KIX domény neovlivnila LTP u myší (obr. 1D). KIX doména umožňuje interakci mezi CREB a CBP, takže vyřazení této oblasti narušuje tvorbu komplexu CREB: CBP. Vyřazení CREB vedlo k podobným výsledkům jako u zmutovaných CBP myší (obr. 1C). Proto jsou inhibice HDAC a asociace CREB: CBP nezbytné pro rozvoj paměti. Léčba TSA ukázala zvýšené hladiny exprese genů Nr4a1 a Nra2, zatímco ostatní geny regulované CREB nebyly ovlivněny. Inhibitory HDAC zlepšují paměť prostřednictvím aktivace specifických genů regulovaných CREB: CBP komplexem.
Úloha jednotlivých HDAC v učení a paměti není dobře pochopena, ale bylo prokázáno, že HDAC2 negativně reguluje tvorbu paměti a synaptickou plasticitu.
Nadměrná exprese (OE) HDAC1 a HDAC2 u myší měla za následek snížení hladin acetylovaných lysinů. Po vystavení těchto myší kontextovým a tónově závislým pokusům s podmíněním strachu se u myší HDAC1 OE nezměnila, ale u myší HDAC2 OE se projevil pokles mrazivého chování, což naznačuje zhoršení tvorby paměti. Na druhé straně myši s knokauty HDAC2 (KO) ilustrovaly zvýšenou hladinu mrazení ve srovnání s myšmi divokého typu (WT), zatímco u myší HDAC1 se projevilo podobné mrazivé chování jako u myší WT. V souhrnu Guan a kol. ukázali, že:
HDAC3 je také negativním regulátorem dlouhodobé potenciační tvorby. McQuown a kol. prokázali, že:
Role HDAC při poruchách CNS
Výzkum ukázal, že HDAC a HAT hrají zásadní roli při poruchách centrálního nervového systému (CNS), jako je Rubinsteinův-Tabyiho syndrom a Rettův syndrom.
Rubinsteinův-Tabyiho syndrom způsobuje mentální retardaci prostřednictvím možných mutací v CREB vázajícím proteinu a p300. Nicméně zvýšení exprese genů závislých na CREB nebo inhibice aktivity HDAC částečně obnovuje ztrátu LTP a zmírňuje pozdní deficity LTP. Inhibitor HDAC podobně jako TSA může poskytnout možnou terapii Rubinsteinova-Tabyiho syndromu.
Další poruchy paměťového deficitu, které mohou zahrnovat inhibitory HDAC jako potenciální terapii, jsou: