Knokautická myš je geneticky upravená myš, u které byl cílenou mutací vypnut jeden nebo více genů.
Myši Knockout jsou důležitými zvířecími modely pro studium role genů, které byly sekvenovány, ale mají neznámé funkce. Tím, že způsobí, že určitý gen je u myši neaktivní a pozoruje jakékoliv rozdíly oproti normálnímu chování nebo stavu, mohou vědci odvodit jeho pravděpodobnou funkci.
Myši jsou v současné době nejvíce příbuzným laboratorním zvířecím druhem člověka, u kterého lze snadno použít techniku knockoutu. Jsou široce používány při experimentech knockoutu, zejména při zkoumání genetických otázek, které se vztahují k lidské fyziologii. Genové knockoutování u potkanů je mnohem těžší a je možné teprve od roku 2003.
První knockoutovou myš vytvořili Mario R. Capecchi, Martin Evans a Oliver Smithies v roce 1989, za což jim byla v roce 2007 udělena Nobelova cena za medicínu. Aspekty technologie pro generování knockoutových myší a myší samotných byly patentovány v mnoha zemích soukromými společnostmi.
Laboratorní myš, u které byl vyřazen gen ovlivňující růst vlasů (vlevo), je zobrazena vedle normální laboratorní myši.
Vyřazení aktivity genu poskytuje informace o tom, co tento gen běžně dělá. Lidé sdílejí mnoho genů s myšmi. Pozorování charakteristik vyřazených myší proto dává výzkumníkům informace, které mohou být použity k lepšímu pochopení toho, jak podobný gen může způsobit nebo přispět k onemocnění u lidí.
Příklady výzkumu, ve kterém byly knockout myši užitečné, zahrnují studium a modelování různých druhů rakoviny, obezity, srdečních onemocnění, cukrovky, artritidy, zneužívání návykových látek, úzkosti, stárnutí a Parkinsonovy nemoci. Knockout myši také nabízejí biologický a vědecký kontext, ve kterém mohou být vyvíjeny a testovány léky a jiné terapie.
Ročně se při pokusech používají miliony knokautovaných myší.
Knokautová myš (vlevo), která je modelem obezity, ve srovnání s normální myší.
Existuje několik tisíc různých kmenů knockout myší.
Mnoho myších modelů je pojmenováno po genu, který byl inaktivován. Například knockout myši p53 je pojmenován po genu p53, který kóduje protein, který normálně potlačuje růst nádorů zastavením buněčného dělení. Lidé narození s mutacemi, které inaktivují gen p53, trpí Li-Fraumeni syndromem, stavem, který dramaticky zvyšuje riziko vzniku rakoviny kostí, rakoviny prsu a rakoviny krve v raném věku. Další myší modely jsou pojmenovány, často s kreativním talentem, podle jejich fyzických vlastností nebo chování.
Postup pro výrobu blastocysty se smíšeným gentotypem.
Schéma chovu pro produkci knokautových myší. Blastocysty obsahující buňky, které jsou divokým typem i knokautovými buňkami, jsou injekčně vpraveny do dělohy pěstounky. Tak vznikají potomci, kteří jsou buď divokého typu a mají stejnou barvu jako dárkyně blastocysty (šedá), nebo chiméry (smíšené) a jsou částečně knokautováni. Myši chiméry jsou zkříženy s normální divokou myší (šedou). Tak vznikají potomci, kteří jsou buď bílí a heterozygotní pro knokautovaný gen, nebo šedí a divoký typ. Bílé heterozygotní myši mohou být následně zkříženy a vznikají myši, které jsou homozygotní pro knokautovaný gen.
Existuje několik variant postupu výroby knockout myší; následující je typickým příkladem.
Podrobné vysvětlení toho, jak vznikají knockout (KO) myši, je umístěno na webových stránkách Nobelovy ceny za fyziologii nebo medicínu 2007 .
Národní zdravotní ústav se zabývá některými důležitými omezeními této techniky.
Technologie knockout myší sice představuje cenný výzkumný nástroj, existují však některá důležitá omezení. Přibližně 15 procent genových knockoutů je vývojově smrtelných, což znamená, že geneticky upravená embrya nemohou vyrůst v dospělé myši. Tento problém je často překonán použitím podmíněných mutací. Nedostatek dospělých myší omezuje studie embryonálního vývoje a často ztěžuje určení funkce genu ve vztahu k lidskému zdraví. V některých případech může gen u dospělých plnit jinou funkci než při vývoji embryí.
Vyřazení genu také nemusí u myši vyvolat pozorovatelnou změnu nebo může dokonce vyvolat jiné charakteristiky než ty, které jsou pozorovány u lidí, u nichž je stejný gen inaktivován. Mutace genu p53 jsou například spojeny s více než polovinou lidských nádorů a často vedou k nádorům v určité skupině tkání. Když je však gen p53 vyřazen u myší, u zvířat se vyvinou nádory v jiné řadě tkání.
V celé proceduře je variabilita v závislosti do značné míry na kmeni, ze kterého byly kmenové buňky odvozeny. Obecně se používají buňky odvozené od kmene 129. Tento specifický kmen není vhodný pro mnoho experimentů (např. behaviorální), proto je velmi časté zpětně křížit potomky s jinými kmeny. Některé genomové lokusy se ukázaly jako velmi obtížné vyřadit. Důvodem může být přítomnost opakujících se sekvencí, rozsáhlá metylace DNA nebo heterochromatin. Matoucí přítomnost sousedních 129 genů na vyřazovacím segmentu genetického materiálu byla nazvána „stopařský efekt“.
Dalším omezením je, že konvenční (tj. nepodmíněné) knockoutové myši se vyvíjejí bez zkoumaného genu. Občas může ztráta aktivity během vývoje zamaskovat roli genu v dospělém stavu, zejména pokud je gen zapojen do mnoha procesů zahrnujících vývoj. Pak jsou vyžadovány podmíněné/indukovatelné mutační přístupy, které nejprve umožní myši normálně se vyvíjet a dospívat před ablací sledovaného genu.