Napěťová svorka pracuje se zápornou zpětnou vazbou. Membránový zesilovač potenciálu měří membránové napětí a vysílá výstup do zesilovače zpětné vazby; tím se odečítá membránové napětí od povelového napětí, které přijímá z generátoru signálu. Tento signál je zesilován a výstup je vysílán do axonu přes proudovou elektrodu.
.
Napěťovou svorku používají elektrofyziologové k měření iontových proudů přes membránu excitovatelných buněk, jako jsou neurony, a zároveň udržují membránové napětí na stanovené úrovni. Buněčné membrány excitovatelných buněk obsahují mnoho různých druhů iontových kanálů, z nichž některé jsou řízeny napětím. Napěťová svorka umožňuje manipulovat s membránovým napětím nezávisle na iontových proudech, což umožňuje studovat vztahy mezi proudem a napětím membránových kanálů.
Koncept napěťové svorky je připisován Kennethu Coleovi a Georgi Marmontovi ve 40. letech 20. století. Cole zjistil, že je možné použít dvě elektrody a zpětnovazební obvod, aby se membránový potenciál buňky udržel na úrovni stanovené experimentátorem.
Alan Hodgkin si uvědomil, že pro pochopení iontového toku přes membránu je nutné eliminovat rozdíly v membránovém potenciálu. Po experimentech s napěťovou svorkou Hodgkin a Andrew Huxley v roce 1952 nastínili iontové příčiny akčního potenciálu, za což se v roce 1963 podělili o Nobelovu cenu za fyziologii nebo medicínu.
Napěťová svorka je proudový generátor se dvěma elektrodami. Transmembránové napětí je zaznamenáváno prostřednictvím „napěťové elektrody“, vzhledem k zemi, a „proudová elektroda“ předává proud do buňky. Experimentátor nastaví „udržovací napětí“, neboli „řídicí potenciál“, a napěťová svorka používá negativní zpětnou vazbu k udržení buňky na tomto napětí. Elektrody jsou připojeny k zesilovači, který měří membránový potenciál a dodává signál do zesilovače zpětné vazby. Tento zesilovač také získává vstup z generátoru signálu, který určuje řídicí potenciál, a odečítá membránový potenciál od řídicího potenciálu (Vcommand – Vm), zvětšuje případný rozdíl a vysílá výstup na proudovou elektrodu. Kdykoli se buňka odchýlí od udržovacího napětí, generuje operační zesilovač „chybový signál“, což je rozdíl mezi řídicím potenciálem a skutečným napětím buňky. Zpětný obvod předává proud do buňky, aby snížil chybový signál na nulu. Tedy svorkový obvod produkuje proud stejný a opačný než iontový proud. Ten lze změřit, což dává přesnou reprodukci proudů proudících přes membránu.
Cole vyvinul techniku napěťové svorky ještě před érou mikroelektrod, takže jeho dvě elektrody se skládaly z jemných drátů omotaných kolem izolační tyče. Protože tento typ elektrody mohl být vložen pouze do největších buněk, byly rané elektrofyziologické experimenty prováděny téměř výhradně na axonech olihní. Olihně stříkají proudy vody, když se potřebují rychle pohybovat, jako když unikají predátorovi. Aby tento únik proběhl co nejrychleji, mají axon, který může dosáhnout průměru 1 mm (signály se rychleji šíří po velkých axonech). Xaxon obří olihně byl prvním přípravkem, který mohl být použit k napěťové svorce transmembránového proudu a byl základem Hodgkinových a Huxleyho průkopnických experimentů s vlastnostmi akčního potenciálu.
Variace techniky napěťových svorek
Podrobnější rozbor níže uvedených technik naleznete v Axon Guide. Kniha je nyní v tištěné podobě, ale lze ji stáhnout ve formátu PDF z Axon Instruments.
Dvouelektrodová napěťová svorka pomocí mikroelektrod
Technika dvoubuněčných napěťových svorek je specializovanou variací dvou elektrodových napěťových svorek a používá se pouze při studiu kanálů mezerové spojky. Mezerové spojky jsou póry, které přímo spojují dvě buňky, kterými volně protékají ionty a malé metabolity. Když jsou dvě buňky, v nichž jsou proteiny mezerové spojky exprimovány buď endogenně, nebo injekcí mRNA, vytvoří se mezi buňkami spojovací kanál. Běžně se používá expresní systém Xenopus laevis oocyte. Protože jsou v systému přítomny dvě buňky, používají se dvě sady elektrod. Do každé buňky se vloží záznamová elektroda a proudová vstřikovací elektroda a každá buňka se sevře jednotlivě (každá sada elektrod je připojena k samostatnému přístroji a integraci dat provádí počítač). Pro záznam spojovací vodivosti se proud mění v první buňce, zatímco záznamová elektroda ve druhé buňce zaznamenává veškeré změny ve Vm pouze pro druhou buňku. (Proces lze zvrátit podnětem, který se vyskytuje ve druhé buňce, a záznamem, který se vyskytuje v první buňce.) Vzhledem k tomu, že elektroda v zaznamenané buňce nevyvolává žádné změny proudu, musí být jakákoli změna napětí vyvolána přechodem proudu do zaznamenané buňky, přes spojovací kanály mezery, z buňky, ve které byl proud proměnlivý.
Jednoelektrodová napěťová svorka
Tato kategorie popisuje soubor technik, při nichž je do buňky vložena jedna elektroda. Tato jediná elektroda vykonává funkce vstřikování proudu i záznamu.
Spojitá svorka s jednou elektrodou (SEV-c)
Technika „patch-clamp“ umožňuje studium jednotlivých iontových kanálů. Používá elektrodu s relativně velkým hrotem (> 1 mikrometr), která má hladký povrch (spíše než ostrý hrot). Jedná se o „patch-clamp elektrodu“ (na rozdíl od „ostré elektrody“ používané k napichování buněk). Tato elektroda je přitisknuta k buněčné membráně a sáním se membrána buňky vtáhne dovnitř hrotu elektrody. Odsávání způsobí, že buňka vytvoří s elektrodou těsné těsnění (tzv. „gigaohm seal“, protože odpor je větší než gigaohm).
SEV-c má tu výhodu, že můžete nahrávat z malých článků, které by nebylo možné napíchnout dvěma elektrodami. Nicméně:
1) Mikroelektrody jsou nedokonalé vodiče; mají obecně odpor více než milion ohmů. Napravují (tj. mění svůj odpor napětím, často nepravidelným způsobem), někdy mají nestabilní odpor, pokud jsou ucpány obsahem buňky. Tudíž nebudou věrně zaznamenávat napětí buňky, zvláště když se rychle mění, ani nebudou věrně předávat proud.
2) Chyby napětí a proudu: obvody SEV-c ve skutečnosti neměří napětí sevřeného článku (stejně jako dvouelektrodová svorka). Zesilovač patch-clamp je jako dvouelektrodová svorka, až na to, že měřící a proudem procházející obvody jsou propojeny (ve svorce se dvěma elektrodami jsou propojeny přes článek). Elektroda je připojena k drátu, který se dotýká proudové/napěťové smyčky uvnitř zesilovače. Elektroda má tedy pouze nepřímý vliv na zpětnovazební obvod. Zesilovač čte pouze napětí na vrcholu elektrody a zpětně přivádí proud ke kompenzaci. Je-li však elektroda nedokonalým vodičem, má svorkový obvod pouze zkreslený pohled na membránový potenciál. Podobně, když obvod zpětně přivádí proud ke kompenzaci tohoto (zkresleného) napětí, bude proud zkreslen elektrodou dříve, než se dostane k článku. Aby to kompenzoval, elektrofyziolog použije elektrodu s nejnižším odporem, ujistí se, že se vlastnosti elektrody během experimentu nemění (takže chyby budou konstantní), a vyhne se zaznamenávání proudů s kinetikou, která bude pravděpodobně příliš rychlá, aby svorka mohla přesně následovat. Přesnost SEV-c stoupá tím pomaleji a tím menší jsou změny napětí, které se snaží svorkovat.
3) Chyby odporu řady: Proudy procházející do buňky musí jít k zemi, aby se obvod dokončil. Napětí jsou zaznamenávána zesilovačem vzhledem k zemi. Když je buňka sevřena svým přirozeným klidovým potenciálem, není problém; svorka neprochází proudem a napětí je generováno pouze buňkou. Ale při sevření jiného potenciálu se stanou problémem chyby sériového odporu; buňka bude procházet proud přes svou membránu ve snaze vrátit se ke svému přirozenému klidovému potenciálu. Zesilovač svorky tomu oponuje tím, že předává proud, aby udržel klidový potenciál. Problém vzniká proto, že elektroda je mezi zesilovačem a buňkou, tj. elektroda je v sérii s rezistorem, který je membránou buňky. Tudíž při průchodu proudu elektrodou a buňkou nám Ohmův zákon říká, že to způsobí vznik napětí jak přes odpor buňky, tak přes odpor elektrody. Protože tyto rezistory jsou v sérii, poklesy napětí se přidají. Pokud mají elektroda a buněčná membrána stejné odpory (což obvykle nemají) a pokud experimentátor nařídí změnu 40mV oproti klidovému potenciálu, zesilovač předá dostatek proudu, dokud nezjistí, že dosáhl změny 40mV. V tomto případě je však polovina tohoto poklesu napětí přes elektrodu. Experimentátor si myslí, že posunul napětí buňky o 40mV, ale posunul ho jen o 20mV. Rozdíl je v „sériové chybě odporu“. Moderní patch-clamp zesilovače mají obvod, který tuto chybu kompenzuje, ale ty kompenzují jen 70-80% z ní. Elektrofyziolog může dále snížit chybu tím, že zaznamená na nebo v blízkosti přirozeného klidového potenciálu buňky a použije co nejnižší odporovou elektrodu.
4) Chyby v kapacitě. Mikroelektrody jsou kondenzátory, a jsou obzvláště problematické, protože jsou nelineární. Kapacita vzniká, protože elektrolyt uvnitř elektrody je oddělen izolátorem (sklem) od roztoku venku. To je, podle definice a funkce, kondenzátor. Horší je, že jak se tloušťka skla mění, čím dál se dostanete od špičky, časová konstanta kondenzátoru se bude lišit. To vytváří zkreslený záznam membránového napětí nebo proudu, kdykoliv se mění. Zesilovače to mohou kompenzovat, ale ne úplně, protože kondenzace má mnoho časových konstant. Experimentátor může snížit problém tím, že udrží koupací roztok buňky mělký (vystaví méně povrchu skla kapalině) a potažením elektrody silikonem, pryskyřicí, barvou nebo jinou látkou, která zvýší vzdálenost mezi vnitřním a vnějším roztokem.
Diskontinuální jednoelektrodová napěťová svorka
Jednoelektrodová napěťová svorka – diskontinuální, neboli SEVC-d, má oproti SEVC-c určité výhody pro záznam celého článku. V tomto případě se volí jiný přístup pro přenos proudu a záznamové napětí. SEVC-d zesilovač pracuje na principu „sdílení času“, takže elektroda pravidelně a často přepíná mezi procházejícím proudem a měřením napětí. Efektivně existují dvě elektrody, ale každá z nich je v provozu jen polovinu doby, kdy je zapnutá. Oscilace mezi dvěma funkcemi jediné elektrody se nazývá střídací cyklus. Během každého cyklu zesilovač měří membránový potenciál a porovnává ho s vyčkávacím potenciálem. Operační zesilovač měří rozdíl a generuje chybový signál. Tento proud je zrcadlovým obrazem proudu generovaného buňkou. Výstupy zesilovače obsahují vzorkovací a zadržovací obvody, takže každé nakrátko odebrané napětí se pak drží na výstupu až do dalšího měření v dalším cyklu. Konkrétně zesilovač měří napětí v prvních několika milisekundách cyklu, generuje chybový signál a zbytek cyklu stráví předáváním proudu, aby tuto chybu snížil. Na začátku dalšího cyklu se opět měří napětí, generuje se nový chybový signál, proud prochází atd. Experimentátor nastavuje délku cyklu a je možné vzorkovat každých 333 až 500 mikrosekund.
Aby to fungovalo, musí být kapacita buňky vyšší než kapacita elektrody alespoň o řád. Kapacita zpomaluje kinetiku (dobu náběhu a poklesu) proudů. Pokud je kapacita elektrody mnohem menší než kapacita buňky, pak se při průchodu proudu elektrodou bude napětí elektrody měnit rychleji než napětí buňky. Když tedy vstříknete proud a pak ho vypnete (na konci pracovního cyklu), bude se napětí elektrody rozkládat rychleji než napětí buňky. Jakmile se napětí elektrody asymptotuje na napětí buňky, může být napětí vzorkováno (znovu) a další množství náboje aplikováno. Frekvence pracovního cyklu je tedy omezena na rychlost, při které napětí elektrody stoupá a klesá při průchodu proudu. Čím nižší je kapacita elektrody, tím rychleji může elektroda kolovat.
SEVC-d má oproti SEVC-c velkou výhodu v tom, že umožňuje experimentátorovi měřit membránový potenciál, a protože zabraňuje průchodu proudu a zároveň měření napětí, nikdy nedochází k sériové odporové chybě. Hlavní nevýhodou je, že rozlišení času je omezené a zesilovač je nestabilní. Pokud předává příliš mnoho proudu, takže je cílové napětí přestřelené, obrátí polaritu proudu v dalším střídacím cyklu. To způsobí, že zesilovač podstříkne cílové napětí, takže další cyklus opět obrátí polaritu vstřikovaného proudu. Tato chyba může s každým cyklem narůstat, dokud zesilovač nezačne nekontrolovaně kmitat („zvonění“); to obvykle vede k destrukci zaznamenané buňky. Vyšetřovatel chce krátký střídací cyklus pro zlepšení časového rozlišení; zesilovač má nastavitelné kompenzátory, které urychlí rozpad elektrodového napětí, ale pokud jsou nastaveny příliš vysoko, zesilovač zazvoní, takže se vyšetřovatel vždy snaží „naladit“ zesilovač co nejblíže hraně nekontrolované oscilace, v takovém případě mohou malé změny v podmínkách záznamu způsobit zvonění. Existují dvě řešení: nastavení zesilovače „odsunout“ do bezpečného rozsahu, nebo být ostražitý pro signály, že se zesilovač chystá zazvonit.