Imunocytochemie označuje jednotlivé proteiny v buňkách, například TH (zelený) v axonech sympatických autonomních neuronů.
Imunocytochemie (ICC) je běžná laboratorní technika, která využívá protilátky, které se zaměřují na specifické peptidy nebo proteinové antigeny v buňce prostřednictvím specifických epitopů. Tyto vázané protilátky pak mohou být detekovány pomocí několika různých metod. ICC umožňuje výzkumníkům vyhodnotit, zda buňky v konkrétním vzorku exprimují dotyčný antigen. V případech, kdy je zjištěn imunopozitivní signál, ICC také umožňuje výzkumníkům určit, které podbuněčné kompartmenty exprimují antigen.
Imunocytochemie vs. imunohistochemie
Imunocytochemie se od imunohistochemie liší v tom, že imunohistochemie se provádí na vzorcích neporušených buněk, kterým byla odstraněna většina, ne-li všechny okolní extracelulární matrice. Patří sem buňky vypěstované v kultuře, uložené ze suspenze nebo odebrané ze stěru. Oproti tomu imunohistochemické vzorky jsou úseky tkáně (biologie), kde je každá buňka obklopena tkáňovou architekturou a dalšími buňkami, které se normálně nacházejí v neporušené tkáni.
Imunocytochemie je technika používaná k posouzení přítomnosti specifické bílkoviny nebo antigenu v buňkách (kultivované buňky, buněčné suspenze) pomocí specifické protilátky, která se na ni váže, čímž umožňuje vizualizaci a vyšetření pod mikroskopem. Je to cenný nástroj pro stanovení buněčného obsahu z jednotlivých buněk. Vzorky, které lze analyzovat, zahrnují krevní stěry, aspirace, výtěry, kultivované buňky, buněčné suspenze a cytospin. S každým vzorkem se zachází odlišně, přesto jsou všechny metody zaměnitelné. Neexistuje jediný způsob, jak připravit tyto typy buněčných vzorků pro imunocytohemickou analýzu.
Buňky, které mají být obarveny, mohou být připevněny k pevnému nosiči, který umožňuje snadnou manipulaci v následných postupech. Toho lze dosáhnout několika metodami: přilnavé buňky mohou být pěstovány na sklíčkách mikroskopu, krycích sklech nebo opticky vhodném plastovém nosiči. Závěsné buňky mohou být odstředěny na sklíčka (cytospin), vázány na pevný nosič pomocí chemických linkerů nebo v některých případech manipulovány v suspenzi.
Koncentrované buněčné suspenze, které existují v médiu s nízkou viskozitou, jsou vhodnými kandidáty pro přípravky na mazání. Zředěné buněčné suspenze existující ve zředěném médiu jsou nejvhodnější pro přípravu cytospinů prostřednictvím cytocentrifugace. Buněčné suspenze, které existují v médiu s vysokou viskozitou, jsou nejvhodnější pro testování jako tamponové přípravky. Konstanta mezi těmito přípravky je taková, že celá buňka je přítomna na povrchu sklíčka. Aby došlo k jakékoli mezibuněčné reakci, musí imunoglobulin nejprve projít buněčnou membránou, která je v těchto přípravcích neporušená. Reakce probíhající v jádře mohou být obtížnější a extracelulární tekutiny mohou vytvářet jedinečné překážky ve výkonu imunocytochemie. V této situaci je nezbytné prostoupit buňky pomocí detergentu (Triton X-100 nebo Tween-20) nebo zvolit organické fixativy (aceton, methanol nebo ethanol).
Přípravek HistoGel překoná potíže s průnikem do buněčného jádra, protože buněčný obal histogelem bude ošetřen jako běžné tkáně pro zalití a sekvenování parafínu. Proto existuje možnost, že buněčné jádro může být prezentováno pro vazbu protilátek.
Protilátky jsou důležitým nástrojem pro prokázání přítomnosti i subcelulární lokalizace antigenu. Barvení buněk je velmi všestranná technika, a pokud je antigen vysoce lokalizovaný, může odhalit až tisíc molekul antigenu v buňce. Za určitých okolností může být barvení buněk použito také k určení přibližné koncentrace antigenu, zejména pomocí obrazového analyzátoru.
Existuje mnoho metod, jak získat imunologickou detekci na tkáních, včetně těch, které jsou vázány přímo na primární protilátky nebo antiséra. Přímá metoda zahrnuje použití detekovatelné značky (např. fluorescenční molekula, zlaté částice atd., ) přímo na protilátku, která se pak může vázat na antigen (např. protein) v buňce.
Alternativně existuje mnoho nepřímých metod. Při jedné takové metodě je antigen vázán primární protilátkou, která je pak zesílena použitím sekundární protilátky, která se váže na primární protilátku. Následně se aplikuje terciální činidlo obsahující enzymatickou část a váže se na sekundární protilátku. Když se aplikuje kvartální činidlo, neboli substrát, enzymatický konec terciálního činidla přemění substrát na produkt pigmentové reakce, který vytvoří barvu (je možné mnoho barev; hnědá, černá, červená atd.,) na stejném místě, kde původní primární protilátka rozpoznala tento sledovaný antigen.
Některé příklady použitých substrátů (také známých jako chromogeny) jsou AEC (3-amino-9-ethylkarbazol) nebo DAB (3,3′-diaminobenzidin). Použití jednoho z těchto činidel po expozici nezbytnému enzymu (např. křenové peroxidáze konjugované na činidlo s protilátkami) vytváří pozitivní produkt imunoreakce. Imunocytochemická vizualizace specifických sledovaných antigenů může být použita v případě, že méně specifické barvivo jako H&E (hematoxylin a eozin) nemůže být použito pro stanovení diagnózy nebo pro poskytnutí dalších prediktivních informací ohledně léčby (například u některých druhů rakoviny).
Alternativně může být sekundární protilátka kovalentně vázána na fluorofor (nejčastější jsou FITC a Rhodamine), který je detekován ve fluorescenčním nebo konfokálním mikroskopu. Umístění fluorescence se bude lišit podle cílové molekuly, vnější pro membránové proteiny a vnitřní pro cytoplazmatické proteiny.V tomto směru je imunofluorescence mocnou technikou v kombinaci s konfokální mikroskopií pro studium umístění proteinů a dynamických procesů (exocytóza, endocytóza, atd.).
Příprava buněk