Vzpřímený fluorescenční mikroskop (Olympus BX61) s fluorescenční krychlovou věží nad objektivy, spojený s digitálním fotoaparátem.
Fluorescenční mikroskop je optický mikroskop, který ke studiu vlastností organických nebo anorganických látek využívá fenomény fluorescence a fosforescence místo odrazu a absorpce nebo vedle nich. „Fluorescenční mikroskop“ označuje jakýkoli mikroskop, který využívá fluorescenci ke generování obrazu, ať už se jedná o jednodušší sestavu, jako je epifluorescenční mikroskop, nebo složitější konstrukci, jako je konfokální mikroskop, který využívá optické dělení k získání lepšího rozlišení fluorescenčního obrazu.
Většina používaných fluorescenčních mikroskopů jsou epifluorescenční mikroskopy (tj. excitace a pozorování fluorescence jsou shora (epi–) vzorkem). Tyto mikroskopy se staly důležitou součástí v oblasti biologie, otevírají dveře pokročilejším mikroskopickým konstrukcím, jako je konfokální mikroskop a celkový vnitřní reflexní fluorescenční mikroskop (TIRF).
Epifluorescenční mikroskopie
Schéma fluorescenčního mikroskopu.
Většina fluorescenčních mikroskopů, zejména těch, které se používají ve vědách o živé přírodě, má epifluorescenční design znázorněný na obrázku. Světlo excitační vlnové délky je zaměřeno na vzorek prostřednictvím objektivní čočky. Fluorescence vyzařovaná vzorkem je zaměřena na detektor stejným cílem, který se používá pro excitaci, která bude mít pro největší citlivost velmi vysokou číselnou aperturu. Vzhledem k tomu, že většina excitačního světla je přenášena přes vzorek, pouze odražené excitační světlo dosáhne cíle společně s vyzařovaným světlem a epifluorescenční metoda tedy dává vysoký poměr signálu a šumu. Dodatečný bariérový filtr mezi cílem a detektorem může odfiltrovat zbývající excitační světlo ze zářivky.
Vzorek spermie sledě obarveného zelení SYBR v kyvetě osvětlené modrým světlem v epifluorescenčním mikroskopu. Zelená barva SYBR ve vzorku se váže na DNA spermie sledě a po vazbě fluoreskuje vydávající zelené světlo při osvětlení modrým světlem.
Aby byl vzorek vhodný pro fluorescenční mikroskopii, musí být fluorescenční. Existuje několik metod vytvoření fluorescenčního vzorku; hlavními technikami jsou značení fluorescenčními barvami nebo v případě biologických vzorků exprese fluorescenční bílkoviny. Alternativně lze použít vnitřní fluorescenci vzorku (tj. autofluorescenci). V oblasti věd o živé přírodě je fluorescenční mikroskopie mocným nástrojem, který umožňuje specifické a citlivé barvení vzorku za účelem zjištění distribuce bílkovin nebo jiných sledovaných molekul. Výsledkem je různorodá škála technik fluorescenčního barvení biologických vzorků.
Biologické fluorescenční skvrny
Mnoho fluorescenčních skvrn bylo navrženo pro řadu biologických molekul. Některé z nich jsou malé molekuly, které jsou vnitřně fluorescentní a vážou se na zajímavou biologickou molekulu. Hlavními příklady jsou skvrny nukleových kyselin jako DAPI a Hoechst, které vážou vedlejší drážku DNA, a tak označují jádra buněk. Jiné jsou léky nebo toxiny, které vážou specifické buněčné struktury a byly derivovány fluorescenčním reporterem. Hlavním příkladem této třídy fluorescenčních skvrn je fluorescenčně značený falloidin, který se používá k barvení aktinových vláken v savčích buňkách.
Existuje mnoho fluorescenčních hlášených molekul, tzv. fluoroforů nebo fluorochromů, jako je fluorescein, Alexa Fluors nebo DyLight 488, které mohou být chemicky vázány na jinou molekulu, která váže cíl zájmu v rámci vzorku.
Imuofluorescence je protilátka založená na technice, která využívá vysoce specifickou vazbu protilátky na její antigen za účelem označení specifických proteinů nebo jiných molekul v buňce. Vzorek je ošetřen primární protilátkou specifickou pro sledovanou molekulu Fluorofor může být přímo konjugován s primární protilátkou. Alternativně může být použita sekundární protilátka, konjugovaná na fluorofor, která se specificky váže na první protilátku. Například primární protilátka získaná u myši, která rozpozná tubulin v kombinaci se sekundární protimyší protilátkou derivovanou fluoroforem, může být použita k označení mikrotubulů v buňce.
Moderní chápání genetiky a dostupných technik pro modifikaci DNA umožňuje vědcům geneticky modifikovat proteiny tak, aby nesli i fluorescenční proteinový reporter. V biologických vzorcích to umožňuje vědcům přímo vyrobit zajímavý protein fluorescentní. Umístění proteinu pak může být přímo sledováno, a to i v živých buňkách.
Fluorofory ztrácejí svou schopnost fluoresce, protože jsou osvětlovány v procesu zvaném fotobělení. K fotobělení dochází, když fluorescenční molekuly hromadí chemické poškození elektrony vybuzené během fluorescence. Fotobílání může výrazně omezit dobu, po kterou může být vzorek pozorován fluorescenční mikroskopií. Existuje několik technik, které omezují fotobělení, jako je použití robustnějších fluoroforů, minimalizace osvětlení nebo použití fotoprotektivních čisticích chemikálií.
Fluorescenční mikroskopie s fluorescenčními reporterovými proteiny umožnila analýzu živých buněk fluorescenční mikroskopií, nicméně buňky jsou citlivé na fototoxicitu, zejména při světle s krátkou vlnovou délkou. Fluorescenční molekuly mají navíc tendenci vytvářet reaktivní chemické druhy při osvětlení, což zvyšuje fototoxický účinek.
Na rozdíl od technik přenášené a odražené světelné mikroskopie umožňuje fluorescenční mikroskopie pouze pozorování specifických struktur, které byly fluorescenčně označeny. Například pozorování vzorku tkáně připraveného fluorescenčním barvením DNA fluorescenční mikroskopií odhalí pouze uspořádání DNA v buňkách a nic jiného o morfologii buněk neodhalí.
Zlepšení a subdifrakční techniky
Vlnový charakter světla omezuje velikost skvrny, na kterou lze světlo zaostřit díky limitu difrakce. Toto omezení bylo popsáno v 19. století Ernstem Abbem a omezuje rozlišení optického mikroskopu na přibližně polovinu vlnové délky použitého světla. Fluorescenční mikroskopie je ústředním prvkem mnoha technik, jejichž cílem je dosáhnout této hranice pomocí specializovaných optických konfigurací.
Ve 20. století bylo vynalezeno několik vylepšení mikroskopických technik, jejichž výsledkem bylo do jisté míry zvýšení rozlišení a kontrastu. Nepřekonaly však difrakční limit. V roce 1978 byly vyvinuty první teoretické nápady na prolomení této bariéry použitím 4Pi mikroskopu jako konfokálního laserového skenovacího fluorescenčního mikroskopu, kde je světlo soustředěno ideálně ze všech stran na společné ohnisko, které se používá ke skenování objektu pomocí excitace ‚bod po bodu‘ v kombinaci s detekcí ‚bod po bodu‘.
První experimentální demonstrace 4pi mikroskopu se však uskutečnila v roce 1994. Mikroskopie 4Pi maximalizuje množství dostupných směrů zaostření použitím dvou protichůdných objektivů nebo Multi-fotonové mikroskopie s použitím rudého posunutého světla a multifotonové excitace.
První technikou, která skutečně dosáhla rozlišení subdifrakce, byla STED mikroskopie, navržená v roce 1994. Tato metoda a všechny techniky podle konceptu RESOLFT se opírají o silnou nelineární interakci mezi světlem a fluoreskujícími molekulami. Molekuly jsou silně poháněny mezi rozlišitelnými molekulárními stavy na každém konkrétním místě, takže nakonec může být světlo vyzářeno pouze na malém zlomku prostoru, tedy se zvýšeným rozlišením.
Stejně tak v 90. letech byla vyvinuta další metoda super rozlišení mikroskopie založená na široké terénní mikroskopii. Podstatně zlepšeného rozlišení velikosti buněčných nanostruktur obarvených fluorescenčním markerem bylo dosaženo vývojem lokalizační mikroskopie SPDM a strukturovaného laserového osvětlení (prostorově modulované osvětlení, SMI). Kombinace principu SPDM s SMI vyústila ve vývoj mikroskopu Vertico SMI. Jednomolekulární detekce normálních blikajících fluorescenčních barviv jako je Green fluorescent protein (GFP) lze dosáhnout pomocí dalšího vývoje SPDM tzv. technologie SPDMphymod, která umožňuje detekovat a spočítat dva různé typy fluorescenčních molekul na molekulární úrovni (tato technologie je označována jako 2CLM, 2 Color Localization Microscopy).
Případně by nástup fotoaktivované lokalizační mikroskopie mohl dosáhnout podobných výsledků tím, že by se spolehl na blikání nebo přepínání jednotlivých molekul, kde je frakce fluoreskujících molekul pokaždé velmi malá. Tato stochastická odezva molekul na aplikované světlo odpovídá také vysoce nelineární interakci vedoucí k rozlišení subdifrakce.