Fluorescenční rezonanční přenos energie (FRET) popisuje mechanismus přenosu energie mezi dvěma fluorescenčními molekulami.
Fluorescenční dárce je vzrušen svou specifickou fluorescenční excitační vlnovou délkou. Dlouhým dipólově-dipólovým spojovacím mechanismem je pak tento excitovaný stav bez záření přenesen na druhou molekulu, akceptor. Dárce se vrací do elektronického základního stavu. Popsaný mechanismus přenosu energie je označován jako „Försterův rezonanční přenos energie“ (FRET), pojmenovaný po německém vědci Theodoru Försterovi. Když jsou obě molekuly fluorescenční, často se používá termín „fluorescenční rezonanční přenos energie“, i když energie není fluorescencí ve skutečnosti přenesena.
Účinnost FRET je určena třemi parametry:
Účinnost FRET , která je definována jako
kde a jsou životnosti dárce fluorescence v přítomnosti a nepřítomnosti akceptora, resp. jako
kde a jsou intenzity fluorescence dárce s akceptorem a bez něj, resp. závisí na vzdálenosti oddělování dárce od akceptora s inverzním zákonem 6. řádu v důsledku dipólovo-dipólového spojovacího mechanizmu: kde a jsou intenzity fluorescence dárce s akceptorem a bez něj, resp. závisí na vzdálenosti oddělování dárce od akceptora s inverzním zákonem 6. řádu v důsledku dipólovo-dipólového spojovacího mechanizmu:
s Försterovou vzdáleností této dvojice dárce a akceptora, při které je účinnost FRET 50%.
Försterova vzdálenost závisí na překryvném integrálu spektra dárce emisí s absorpčním spektrem akceptoru a jejich vzájemné molekulární orientaci vyjádřené touto rovnicí:
kde je dipólový orientační faktor, je index lomu média, je fluorescenční kvantový výtěžek dárce v nepřítomnosti akceptora a je spektrální překryvný integrál vypočtený jako
kde je normalizované donorové emisní spektrum a je akceptorový molární extinkční koeficient.
Často se předpokládá κ2 =2/3. Tato hodnota se získá, když se obě barviva volně otáčejí a lze je považovat za izotropicky orientované během excitovaného stavu. Pokud je jedno z barviv neměnné nebo se nemůže volně otáčet, pak κ2 =2/3 nebude platný předpoklad. Ve většině případů však i mírná reorientace barviv vede k dostatečnému orientačnímu zprůměrování, že κ2 = 2/3 nevede k velké chybě v odhadované vzdálenosti přenosu energie vzhledem k závislosti šesté mocniny R0 na κ2. I když je κ2 zcela odlišné od 2/3, chyba může být spojena s posunem v R0 a tudíž určení změn relativní vzdálenosti pro určitý systém je stále platné. Fluorescenční proteiny se nereorientují v časovém měřítku, které je rychlejší než jejich fluorescenční životnost. V tomto případě 0 ≤ κ2 ≤ 4.
Ve fluorescenční mikroskopii, fluorescenční konfokální laserové skenovací mikroskopii, stejně jako v molekulární biologii, je FRET užitečným nástrojem pro kvantifikaci molekulární dynamiky v biofyzice a biochemii, jako jsou protein-proteinové interakce, protein-DNA interakce a protein konformační změny.
Využití FRET v neurovědách
==Postupy
Pro sledování složité formace mezi dvěma molekulami je jedna z nich označena dárcem a druhá akceptorem a tyto fluorofory označené molekuly se smíchají. Když jsou disociovány, je při excitaci dárce detekována emise dárce. Na druhé straně, když se dárce a akceptor nacházejí v těsné blízkosti (1-10 nm) v důsledku interakce obou molekul, je emise akceptoru pozorována především díky intermolekulární FRET od dárce k akceptoru. Pro sledování konformačních změn proteinu je cílový protein označen dárcem a akceptorem na dvou lokusech. Když zkroucení nebo ohnutí proteinu přináší změnu vzdálenosti nebo relativní orientace dárce a akceptora, je pozorována změna FRET. Pokud je molekulární interakce nebo konformační změna proteinu závislá na vazbě ligandu, je tato metoda FRET použitelná pro fluorescenční indikátory pro detekci ligandu.
Nejpopulárnější dvojicí FRET pro biologické použití je dvojice cyan fluorescent protein (CFP)-žlutý fluorescenční protein (YFP). Obě jsou barevnými variantami zeleného fluorescenčního proteinu (GFP). Zatímco značení organickými fluorescenčními barvivy vyžaduje problematické procesy čištění, chemické modifikace a intracelulární injekci hostitelského proteinu, GFP varianty lze snadno připojit k hostitelskému proteinu pomocí genetického inženýrství. Díky GFP variantám je využití FRET technik pro biologický výzkum stále populárnější.
Omezením FRET je požadavek, aby vnější osvětlení iniciovalo přenos fluorescence, což může vést k šumu pozadí ve výsledcích z přímého excitování akceptoru, nebo fotobělení. K překonání této obtíže byl vyvinut Bioluminescence Resonance Energy Transfer (nebo BRET). Tato technika používá bioluminescenční luciferázu (typicky luciferázu z Renilla reniformis) spíše než CFP k vytvoření počáteční fotonové emise kompatibilní s YFP.
FRET a BRET jsou také běžnými nástroji ve studiu kinetiky biochemické reakce a molekulárních motorů.
Jiným, ale příbuzným mechanismem je Dexter Energy Transfer.
Alternativní metodou k detekci protein-proteinové blízkosti je BiFC, kde jsou dvě poloviny YFP spojeny do proteinu (Hu, Kerppola et al. 2002). Když se tyto dvě poloviny setkají, vytvoří fluorofor po cca 60s – 1 hod.
FRET může být kvantifikován v experimentech na bázi kyvety nebo v mikroskopických snímcích na bázi pixelů. Tato kvantifikace může být založena přímo (metoda senzibilizované emise) na detekci dvou emisních kanálů za dvou různých excitačních podmínek (primárně dárce a primárně příjemce). Z důvodů robustnosti je však kvantifikace FRET nejčastěji založena na měření změn intenzity fluorescence nebo životnosti fluorescence při změně experimentálních podmínek. Např. snímek dárcovské emise z mikroskopu je pořízen za přítomnosti příjemce. Přijímač je pak bělen tak, že není schopen přijmout přenos energie a je pořízen jiný snímek dárcovské emise. Kvantifikace na bázi pixelů pomocí druhé rovnice v oddílu teorie výše je pak možná. Alternativní způsob dočasné deaktivace příjemce je založen na jeho fluorescenční saturaci.
Využití polarizačních charakteristik světla a kvantifikace FRET je také možná pouze při jedné expozici fotoaparátu.