Mezerová křižovatka neboli nexus je specializované mezibuněčné spojení mezi množstvím živočišných buněčných typů. Přímo spojuje cytoplazmu dvou buněk, což umožňuje volný průchod různých molekul a iontů mezi buňkami.
Jeden spojovací kanál je složen ze dvou konexonů
(nebo hemichannelů), které se spojují v mezibuněčném prostoru. Mezerové spoje jsou analogické k plasmodesmatům, které spojují rostlinné buňky.
U obratlovců jsou gap junction hemichannels primárně homo- nebo hetero-hexamery konexinových proteinů. Invertebrate gap junctions zahrnují proteiny z hypotetické rodiny innexinů. Nicméně nedávno charakterizovaná rodina pannexinů, o které se původně předpokládalo, že tvoří mezibuněčné kanály (na základě podobné sekvenční podobnosti aminokyselin s innexiny), ve skutečnosti funguje jako jednomembránové kanály, které komunikují s extracelulárním prostředím a bylo prokázáno, že procházejí vápníkem a ATP.
Na mezerových křižovatkách je mezibuněčný prostor 4 nm a jednotkové konexony v membráně každé buňky jsou vzájemně seřazeny.
Kanály Gap junction vytvořené ze dvou identických hemichannelů se nazývají homotypické, zatímco ty s odlišnými hemichannely jsou heterotypické. Naopak hemichannely s jednotným složením konexinu se nazývají homomerické, zatímco ty s odlišnými konexiny jsou heteromerické. Předpokládá se, že složení kanálů ovlivňuje funkci kanálů gap junction.
Obecně platí, že geny kódující gap junction kanály jsou klasifikovány do jedné ze tří skupin, na základě sekvenční podobnosti: A, B a C (například GJA1, GJC1). Geny však nekódují přímo pro expresi gap junction kanálů; geny mohou produkovat pouze proteiny, které tvoří gap junction kanály (konexiny). Populární je také alternativní systém pojmenování založený na molekulární hmotnosti tohoto proteinu (například: GJA1, GJB4).
Vlastnosti dvojic connexonových kanálů
Příklady barviva vstříknutého do jedné buňky pohybující se do sousedních buněk přes mezerové spoje
K dnešnímu dni bylo proteinu gap junction přiřazeno pět různých funkcí:
Výskyt a distribuce
Mezery byly pozorovány v různých zvířecích orgánech a tkáních, kde se buňky vzájemně kontaktují. Od padesátých do sedmdesátých let byly detekovány v rakovitých nervech, slinivce potkaní, játrech, kůře nadledvin, nadvarleti, dvanáctníku, svalu, Daphnia hepatic caecum, svalu Hydra, sítnici opic, králičí rohovce, rybím blastodermu, žabích embryích, králičích vaječnících, re-agregačních buňkách, švábích hemocytech kapslích, králičí kůži, kuřecích embryích, lidských ostrůvcích Langerhans, zlatých rybek a křečků snímajících tlak akusticko-vestibulárních receptorů, mihule a tunicate srdce, potkaních seminiferních tubulů, myometria, očních čoček a ¬ cefalopodního trávicího epitelu. Od sedmdesátých let byly mezery nadále nalezeny téměř ve všech zvířecích buňkách, které se vzájemně dotýkají. Do devadesátých let nová technologie, jako je konfokální mikroskopie, umožnila rychlejší průzkum velkých oblastí tkání. Od 70. let 20. století dokonce i tkáně, které byly tradičně považovány za možná izolované buňky, jako je kost, ukázaly, že buňky byly stále spojeny s mezerovými spoji, i když jen tence. Mezerové spoje se zdají být ve všech živočišných orgánech a tkáních a bude zajímavé najít k tomu výjimky jiné než buňky, které nejsou normálně v kontaktu se sousedními buňkami. Možnou výjimkou je kosterní svalovina dospělých. Lze namítnout, že pokud se vyskytují v mezerových spojích kosterního svalstva, mohou se kontrakce šířit libovolným způsobem mezi buňkami tvořícími sval. Alespoň v některých případech tomu tak nemusí být, jak se ukazuje u jiných typů svalů, které mezerové spoje mají. Údaj o tom, co vyplývá z redukce nebo absence mezerových spojů, lze naznačit analýzou nádorů nebo procesem stárnutí.
Oddíl „Oblasti elektrického spojení“ odráží okolnosti prvotního objevu mezerových spojení a jejich funkci při umožnění přenosu elektrických impulsů mezi buňkami na úrovních, které vyvolávají reakce sousedních buněk. Přenos nervového impulsu a kontrakce svalů jsou poměrně snadno experimentálně detekovány a kvantifikovány. „Oblasti elektrického spojení“ se také dotýkají mezerových spojení sítnice, které by mohly být považovány za specializované nervové buňky. Od těchto prvních let bylo odhaleno mnoho nových funkcí mezerových spojení.
Vývoj embryonálních orgánů a tkání
V 80. letech 20. století byly zkoumány jemnější, ale neméně důležité role komunikace pomocí mezerové křižovatky. Bylo zjištěno, že komunikace pomocí mezerové křižovatky může být narušena přidáním protilátek proti konexinu do embryonálních buněk. Embrya s oblastmi blokovaných mezerových křižovatek se nevyvíjela normálně. Mechanismus, kterým protilátky blokovaly mezerové křižovatky, byl nejasný, ale byly provedeny systematické studie k objasnění mechanismu. Zpřesnění těchto studií ukázalo, že mezerové křižovatky se zdály být klíčem k rozvoji buněčné polarity a symetrie/asymetrie vlevo/vpravo u zvířat. Zatímco signalizace, která určuje polohu tělesných orgánů, se zdá být závislá na mezerových křižovatkách, stejně tak se zdá, že je závislá na zásadnější diferenciaci buněk v pozdějších fázích embryonálního vývoje.
Bylo také zjištěno, že mezerové křižovatky jsou zodpovědné za přenos signálů nutných k tomu, aby léky měly účinek, a naopak bylo prokázáno, že některé léky blokovaly kanály mezerové křižovatky.
Mezerové křižovatky a „efekt přihlížejícího“
„Efekt kolemjdoucího“ se svými konotacemi zabitého nevinného kolemjdoucího je také zprostředkován mezerovými křižovatkami. Když jsou buňky ohroženy v důsledku nemoci nebo zranění a začnou umírat, jsou zprávy přenášeny do sousedních buněk připojených k umírající buňce mezerovými křižovatkami. To může způsobit, že jinak nezasažené zdravé buňky kolemjdoucího také zemřou. Efekt kolemjdoucího je proto důležité zvážit u nemocných buněk, které otevřely cestu k většímu financování a rozkvětu výzkumu. Později byl efekt kolemjdoucího zkoumán také s ohledem na buňky poškozené radiací nebo mechanickým poraněním a tedy hojení ran. Zdá se, že nemoc má také vliv na schopnost mezerových křižovatek plnit své role při hojení ran.
I když se vzhledem k možnosti terapeutických cest objevuje tendence soustředit se na vedlejší efekt u onemocnění, existují důkazy, že v normálním vývoji tkání hraje ústřední roli více. Aby tkáň dosáhla své konečné konfigurace, může být nutná smrt některých buněk a jejich okolní matrice a pro tento proces se také jeví jako zásadní mezerové křižovatky. Existují také složitější studie, které se snaží spojit naše chápání souběžných rolí mezerových křižovatek jak v hojení ran, tak ve vývoji tkání.
Oblasti elektrických spojek
Mezerové spoje elektricky a chemicky spojují buňky v celém těle většiny zvířat. Elektrické spoje mohou působit poměrně rychle. Tkáně v této části mají dobře známé funkce, u nichž je pozorováno, že jsou koordinovány mezerovými spoji s mezibuněčnou signalizací odehrávající se v časových rámcích mikrosekund nebo méně.
Mezery jsou zvláště důležité v srdečním svalu: signál ke kontrakci je účinně předáván mezerami, což umožňuje, aby se buňky srdečního svalu smršťovaly v tandemu. Mezery jsou vyjádřeny prakticky ve všech tkáních těla, s výjimkou dospělých plně vyvinutých kosterních svalů a typů mobilních buněk, jako jsou spermie nebo erytrocyty. S mutacemi genů mezer je spojeno několik lidských genetických poruch. Mnoho z nich ovlivňuje kůži, protože tato tkáň je silně závislá na komunikaci mezer pro regulaci diferenciace a proliferace.
Mezerová křižovatka nacházející se v neuronech je často označována jako elektrická synapse. Elektrická synapse byla objevena pomocí elektrických měření předtím, než byla popsána struktura mezerové křižovatky. Bylo objeveno jen málo míst, kde dochází k významnému propojení neuronů v mozku. Struktury v mozku, u kterých bylo prokázáno, že obsahují elektricky spojené neurony, zahrnují vestibulární jádro, jádro trojklaného nervu, dolní jádro olivary a ventrální tegmentální oblast. Bylo pozorováno slabé propojení neuronů s gliálními buňkami v lokusu coeruleus a v mozečku mezi Purkyňovými neurony a Bergmannovými gliálními buňkami. Zdá se, že astrocyty jsou spojeny mezerovými křižovatkami, a to jak s jinými astrocyty, tak s oligodendrocyty. Navíc mutace v genech mezerové křižovatky Cx43 a Cx56.6 způsobují degeneraci bílé hmoty podobnou té, která byla pozorována u Pelizaeovy-Merzbacherovy choroby a roztroušené sklerózy.
s mRNA pro nejméně pět dalších konexinů (mCx26, mCx30.2, mCx32, mCx43, mCx47) detekovaných, ale bez imunocytohemických důkazů pro odpovídající protein v rámci ultrastrukturně definovaných mezerových křižovatek.
Uvedené mRNA se zdají být sníženou regulací nebo zničeny mikrointerferujícími RNA ( miRNA ), které jsou specifické pro buněčný typ a buněčnou linii.
Neurony v sítnici vykazují rozsáhlé spojení, a to jak v rámci populací jednoho typu buněk, tak i mezi různými typy buněk.
Odkud se to jméno vzalo?
Mezerové křižovatky byly takto pojmenovány kvůli „mezeře“, která byla prokázána na těchto speciálních křižovatkách mezi dvěma buňkami. Se zvýšeným rozlišením transmisního elektronového mikroskopu (TEM) byly struktury mezerových křižovatek poprvé vidět a popsány kolem roku 1953.
Průřez křižovatky Annulární mezery v tenkém úseku TEM. Křižovatky mezer jsou obvykle v tenkých úsecích TEM spíše lineární než prstencové. Má se za to, že křižovatky prstencové mezery vznikají zachycením jedné ze dvou buněk membránového plaku a vytvářejí uvnitř buňky váček. Tento příklad ukazuje tři vrstvy do struktury křižovatky. Membrána z každé buňky je tmavá čára s bělejší úzkou mezerou mezi dvěma tmavě zbarvenými membránami. V takových elektronových mikrografech může být až 7 vrstev. Dvě lipidové monovrstvy v každé membráně mohou obarvit jako 3 vrstvy plus jedna vrstva z mezery mezi nimi, podobně jako dva chlebové chlebíčky s prostorem mezi nimi.
Pojem „mezerová křižovatka“ vznikl zřejmě o 16 let později kolem roku 1969. Podobná úzká pravidelná mezera nebyla prokázána u jiných mezibuněčných křižovatek fotografovaných tehdejším TEM.
Forma a indikátor funkce
Dlouho před demonstrací „mezery“ v mezerových křižovatkách byly viděny na křižovatce sousedních nervových buněk. Těsná blízkost sousedních buněčných membrán na mezerové křižovatce vede výzkumníky ke spekulacím, že hrály roli v mezibuněčné komunikaci, zejména v přenosu elektrických signálů.[80][81][82] Mezerové křižovatky byly také prokazatelně elektricky usměrňovány a označovány jako elektrická synapse.[83][84] Později bylo zjištěno, že chemikálie mohly být také přenášeny mezi buňkami mezerovými křižovatkami.[85] Implicitní nebo explicitní ve většině raných studií je, že oblast mezerové křižovatky byla strukturou odlišná od okolních membrán způsobem, který ji odlišoval. Ukázalo se, že mezerová křižovatka vytvořila mikroprostředí mezi oběma buňkami v mimobuněčném prostoru neboli „mezeře“. Tato část mimobuněčného prostoru byla poněkud izolována od okolního prostoru a také přemostěna tím, co dnes nazýváme konexonovými páry, které tvoří ještě těsněji uzavřené mosty, které protínají mezerovou křižovatkovou mezeru mezi dvěma buňkami. Při pohledu v rovině membrány technikami freeze fracture je možná distribuce konexonů s vyšším rozlišením v rámci mezerové křižovatkové plakety.[86] V některých křižovatkách jsou pozorovány Connexinovy volné ostrovy. Pozorování bylo většinou bez vysvětlení, dokud Peracchia neukázal, že vezikuly jsou pomocí TEM tenké úseky systematicky spojovány s mezerovými křižovatkovými plaky.[87] Peracchiova studie byla pravděpodobně také první studií popisující párové konexonové struktury, které nazval poněkud jednoduše „globule“. Studie ukazující vezikuly spojené s mezerovými křižovatkami a navrhující obsah vezikul se může pohybovat po spojovacích placích mezi dvěma buňkami byly vzácné, protože většina studií se zaměřila spíše na konexony než na vezikuly. Pozdější studie používající kombinaci mikroskopických technik potvrdila první důkaz pravděpodobné funkce pro mezerové křižovatky v mezibuněčném přenosu vezikul. Oblasti přenosu vezikul byly spojeny s konexinovými volnými ostrovy uvnitř mezerových křižovatkových plaků.[88]
Mezery a elektrické a chemické nervové synapse
Vzhledem k rozšířenému výskytu mezerových křižovatek v jiných typech buněk, než jsou nervové buňky, se termín mezerová křižovatka začal používat obecněji než termíny jako elektrická synapse nebo nexus. Další rozměr ve vztahu mezi nervovými buňkami a mezerovými křižovatkami byl odhalen studiem tvorby chemické synapse a přítomnosti mezerové křižovatky. Sledováním vývoje nervů u pijavic s potlačenou expresí mezerové křižovatky bylo prokázáno, že obousměrná mezerová křižovatka (elektrická nervová synapse) se musí vytvořit mezi dvěma buňkami, než mohou vyrůst a vytvořit jednosměrnou „chemickou nervovou synapsi“.[89] Chemická nervová synapse je synapse nejčastěji zkrácená na nejednoznačný termín „nervová synapse“.
Z čeho je tvořena mezerová křižovatka?
Purifikace[90][91] mezibuněčných spojovacích plaků obohacených kanálem tvořícím protein (konexin) ukázala protein tvořící šestiúhelníková pole v rentgenové difrakci. Nyní bylo možné systematicky studovat a identifikovat převládající protein spojovacího kanálu[92].
Rafinované ultrastrukturální studie podle TEM [93][94] ukázaly, že protein se vyskytuje komplementárně v obou buňkách účastnících se plaku spojovacího kanálu. Plak spojovacího kanálu je relativně velká plocha membrány pozorovaná v TEM tenké části a mrazové fraktuře (FF) pozorovaná vyplněná trans-membránovými proteiny v obou tkáních a šetrněji ošetřenými přípravky spojovacího kanálu. Se zjevnou schopností jednoho proteinu samotného umožnit mezibuněčnou komunikaci pozorovanou v spojovacích kanálech[95] se termín spojovací kanál stával synonymem pro skupinu seskupených konexinů, ačkoliv to nebylo prokázáno in vivo. Biochemická analýza izolátů bohatých na mezerové křižovatky z různých tkání prokázala rodinu konexinů.[96][97][98]
Ultrastruktura a biochemie již zmiňovaných izolovaných mezerových křižovatek naznačila, že konexiny se přednostně seskupují v mezerových křižovatkách plaky nebo domény a konexiny jsou nejlépe charakterizovanou složkou. Bylo zaznamenáno, že uspořádání proteinů do polí s mezerovou křižovatkou plaketou může být významné.[99] Je pravděpodobné, že tato raná práce již odrážela přítomnost více než jen konexinů v mezerových křižovatkách. Kombinace vznikajících polí freeze-fracture k vidění uvnitř membrán a imunocytochemie k označení buněčných složek (Freeze-fracture replica immunolabelling nebo FRIL a tenký úsek immunolabelling) ukázala, že mezerové křižovatky plakety in vivo obsahovaly konexinový protein.[100][101] Pozdější studie používající imunofluorescenční mikroskopii větších oblastí tkáně objasnily různorodost v dřívějších výsledcích. Plaky Gap junction byly potvrzeny, že mají variabilní složení, protože jsou domovem proteinů connexonu a non-connexinu a zároveň činí moderní použití pojmů „gap junction“ a „gap junction plaque“ nezaměnitelným.[102] Jinými slovy, běžně používaný termín „gap junction“ vždy odkazuje na strukturu, která obsahuje konexiny, zatímco plak gap junction může také obsahovat další strukturální znaky, které ji budou definovat.
„Plaketa“ nebo „formační plaketa“
Dřívější popisy „gap junctions“ a „connexonů“ na ně jako na takové neodkazovaly a bylo použito mnoho dalších termínů. Je pravděpodobné, že „synaptické disky“ [103] byly přesným odkazem na gap junction plaques. Zatímco podrobná struktura a funkce connexonu byla v té době popsána omezeným způsobem, hrubá „disková“ struktura byla relativně velká a byla snadno viditelná různými technikami TEM. Disky umožnily výzkumníkům používajícím TEM snadno najít konexony obsažené v disku jako záplaty in vivo a in vitro. Disk nebo „plak“ měl zřejmě jiné strukturální vlastnosti než samotné konexony. Mělo se za to, že pokud by byla oblast membrány v plaku přenášených signálů, musela by být oblast membrány nějakým způsobem utěsněna, aby se zabránilo úniku.[104]
Pozdější studie ukázaly, že plaky na mezerové křižovatce jsou domovem nespojených proteinů, díky čemuž je moderní použití pojmů „mezerová křižovatka“ a „plak na mezerové křižovatce“ nezaměnitelné, protože oblast plaku na mezerové křižovatce může obsahovat jiné proteiny než konexiny.[102][105] Stejně jako konexiny ne vždy zabírají celou plochu plaku, ostatní komponenty popsané v literatuře mohou být pouze dlouhodobými nebo krátkodobými rezidenty.[106]
Studie umožňující pohledy uvnitř roviny membrány mezerových křižovatek během formování naznačily, že mezi dvěma buňkami se před vstupem a výstupem spojivek vytvořila „formační plaketa“. Byly to oblasti bez částic, když je pozoroval TEM FF, což naznačovalo, že jsou pravděpodobně přítomny velmi malé nebo žádné transmembránové proteiny. O tom, jaké struktury tvoří formační plaketu nebo jak se mění struktura formační plakety, když se spojky a další složky pohybují dovnitř nebo ven, je známo jen málo. Jedna z dřívějších studií tvorby malých mezerových křižovatek popisuje řady částic a aureoly bez částic.[107] U větších mezerových křižovatek byly popsány jako formační plaky, do kterých se pohybují spojky. Předpokládalo se, že mezerové křižovatky s částicemi se vytvoří 4–6 hodin poté, co se objevily formační plaky.[108] Jak mohou být spojky transportovány na plaky pomocí tubulinu, je stále jasnější.[109]
Imunofluorescenční mikroskopické video konexinů pohybujících se podél mikrotubulů na povrch buňky.
Formační plak a nespojená část klasické plakety s mezerovým spojením byly pro rané výzkumníky obtížně analyzovány. V TEM FF a tenkém úseku se jeví jako lipidová membránová doména, která může nějakým způsobem tvořit komparativně tuhou bariéru vůči jiným lipidům a proteinům. Existují nepřímé důkazy o tom, že určité lipidy jsou přednostně zapojeny do formačního plaku, ale to nelze považovat za definitivní.[110][111] Je obtížné představit si rozbití membrány pro analýzu membránových plaků, aniž by to ovlivnilo jejich složení. Studiem konexinů dosud v membránách byly zkoumány lipidy spojené s konexiny.[112] Bylo zjištěno, že specifické konexiny měly tendenci spojovat se přednostně se specifickými fosfolipidy. Vzhledem k tomu, že formační plaky předcházejí konexinům, tyto výsledky stále neposkytují jistotu, co je na složení samotných plaků jedinečné. Jiná zjištění ukazují, že konexiny se spojují s proteinovými lešeními použitými v jiné křižovatce, zonula occludens ZO1.[113] I když nám to pomáhá pochopit, jak mohou být konexiny přemístěny do plaku formace mezerového křižovatky, složení samotného plaku je stále poněkud útržkovité. Určitý pokrok v in vivo složení plaku mezerového křižovatky je dosažen pomocí TEM FRIL.[113][106]
Sloupcový (jednoduchý, stratifikovaný) – Cuboidal (jednoduchý, stratifikovaný) – PseudostRatifikovaný/Respirační – Squamous (jednoduchý, stratifikovaný) – Přechodný – Čichový
Laterální/buněčná: Těsná spojnice – Spojení adherenů – Desmosom – Spojení mezer Bazální/buněčná matice: Bazální lamina – Hemidesmozom – Ohnisková adheze Apikální: Cilia – Microvilli – Stereocilia
Iontový kanál gating –
Cesta MAPK/ERK –
Mechanotransdukce –
Fototransdukce –
Systémy druhého messengeru –
Synaptický přenos