V neuroregeneraci je vodicí nervové potrubí (také označované jako umělé nervové potrubí nebo umělý nervový štěp, na rozdíl od autogenního štěpu) umělým prostředkem vedení axonálního regrowthu pro usnadnění regenerace nervů a je jednou z několika klinických léčeb nervových poranění. Pokud nelze přímé sešití dvou pahýlů přerušeného nervu provést bez napětí, je standardní klinickou léčbou periferních nervových poranění autologní nervové štěpení. Vzhledem k omezené dostupnosti dárcovské tkáně a funkční obnově při autologním nervovém štěpení se výzkum inženýrství nervové tkáně zaměřil na vývoj bioumělých nervových vodicích potrubí jako alternativní léčby, zejména u velkých defektů. Podobné techniky jsou také zkoumány pro opravu nervů v míše, ale nervová regenerace v centrálním nervovém systému představuje větší výzvu, protože jeho axony se v přirozeném prostředí znatelně neregenerují.
Vytváření umělých vodičů je také známé jako entubulace, protože nervové konce a zasahující mezera jsou uzavřeny v trubici složené z biologických nebo syntetických materiálů. Ať už je vodič ve formě biologické trubice, syntetické trubice nebo vodiče tkáňového inženýrství, měl by usnadňovat neurotropní a neurotrofickou komunikaci mezi proximálním a distálním koncem nervové mezery, blokovat vnější inhibiční faktory a poskytovat fyzikální vedení pro regeneraci axonu. Nejzákladnějším cílem vodiče nervu je kombinovat fyzikální, chemické a biologické podněty za podmínek, které podpoří tvorbu tkáně.
Materiály, které byly použity k výrobě biologických trubic, zahrnují cévy a kosterní svalstvo, zatímco nevstřebatelné a biologicky vstřebatelné syntetické trubice byly vyrobeny ze silikonu, respektive z polyglykolidu. Nervové vodicí trubice tkáňového inženýrství jsou kombinací mnoha prvků: konstrukce lešení, materiál lešení, buněčné terapie, neurotrofické faktory a biomimetické materiály. Výběr toho, které fyzikální, chemické a biologické podněty použít, je založen na vlastnostech nervového prostředí, které je rozhodující při vytváření nejžádanějšího prostředí pro regeneraci axonu. Mezi faktory, které řídí výběr materiálu, patří biologická kompatibilita, biologická rozložitelnost, mechanická integrita, ovladatelnost během růstu nervu, implantace a sterilizace.
Nejzákladnější charakteristikou nervového vodicího vedení je jeho trojrozměrná struktura, neboli topografie lešení. Topografie lešení může ovlivnit různé růstové parametry implantovaných buněk, jako je adheze buněk, morfologie, životaschopnost, apoptóza, genetická regulace a motilita. V tkáňovém inženýrství se za tři hlavní úrovně struktury lešení považují:
Nástavba potrubí nebo lešení je důležitá pro simulaci podmínek in vivo pro tvorbu nervové tkáně. Extracelulární matrix, která je zodpovědná především za řízení růstu a tvorby tkáně, má složitou nástavbu vytvořenou mnoha vzájemně propletenými vláknitými molekulami. Způsoby vytváření umělé nástavby zahrnují použití hydrogelů reagujících na teplo, podélně orientovaných kanálů, podélně orientovaných vláken, napínacích axonů a nanovláknitých lešení.
Na teplo reagující hydrogely
Při traumatickém poranění mozku (TBI) je iniciována řada škodlivých událostí, které vedou k buněčné smrti a celkové dysfunkci, což způsobuje vznik nepravidelně tvarované dutiny léze. Výsledná dutina způsobuje mnoho problémů pro lešení tkáňového inženýrství, protože je nutná invazivní implantace a lešení často neodpovídá tvaru dutiny. Aby bylo možné tyto obtíže obejít, byly tepelně reagující hydrogely navrženy tak, aby prošly přechody mezi roztokem a gelem (sol-gel), které jsou způsobeny rozdíly v pokojových a fyziologických teplotách, aby usnadnily implantaci skrze in situ gelaci a konformaci do tvaru dutiny, což umožňuje jejich aplikaci minimálně invazivním způsobem.
Methylcelluosa (MC) je materiál s přesně definovanými přechody sol-gelu v optimálním rozsahu teplot. K gelaci MC dochází v důsledku zvýšení intra- a intermolekulárních hydrofobních interakcí se zvyšující se teplotou. Přechod sol-gelu je řízen nižší kritickou teplotou roztoku (LCST), což je teplota, při které se elastický modul rovná viskóznímu modulu. LCST nesmí překročit fyziologickou teplotu (37 °C), pokud má lešení po implantaci gelovat a vytvořit tak minimálně invazivní porod. Po implantaci do TBI lézní dutiny nebo periferního nervového vodicího kanálu vyvolá MC minimální zánětlivou reakci. Pro minimálně invazivní porod je také velmi důležité, aby měl roztok MC viskozitu při teplotách nižších, než je jeho LCST, což umožňuje jeho injekci přes jehlu malého kalibru pro implantaci in vivo aplikacím. MC se úspěšně používá jako prostředek pro podání intraoptické a perorální farmaceutické léčby. Mezi některé nevýhody MC patří jeho omezená náchylnost k adsorpci proteinů a adheze neuronů na buňky, což z něj dělá nebioaktivní hydrogel. Vzhledem k těmto nevýhodám použití MC při regeneraci nervové tkáně vyžaduje připojení biologicky aktivní skupiny na polymerovou páteř, aby se zvýšila adheze buněk.
Další termorezistentní gel je ten, který vzniká spojením chitosanu s glycerofosfátovou (GP) solí. Tento roztok zažívá gelaci při teplotách nad 37 °C. Gelace chitosanu/GP je poměrně pomalá, trvá půl hodiny, než je původně nastaven a dalších 9 hodin, než je zcela stabilizován. Síla gelu se pohybuje od 67 do 1572 Pa v závislosti na koncentraci chitosanu; spodní hranice tohoto rozmezí se blíží tuhosti mozkové tkáně. Chitosan/GP prokázal úspěch in vitro, ale přidání polylysinu je nutné pro posílení vazby nervových buněk. Polylysin byl kovalentně navázán na chitosan, aby se zabránilo jeho difúzi. Polylysin byl vybrán kvůli jeho pozitivní povaze a vysoké hydrofilitě, která podporuje růst neuritu. Přežití neuritu bylo zdvojnásobeno, i když výrůstek neuritu se s přidaným polylysinem nezměnil.
Podélně orientované kanály
Podélně orientované kanály jsou makroskopické struktury, které mohou být přidány do potrubí, aby regenerující se axony měly dobře definované vodítko pro růst přímo podél lešení. Na lešení s architekturou mikrotubulárních kanálů jsou regenerující axony schopny protahovat se otevřenými podélnými kanály, jako by normálně protahovaly endoneurální trubice periferních nervů. Kanály navíc zvětšují plochu, která je k dispozici pro buněčný kontakt. Kanály jsou obvykle vytvořeny vložením jehly, drátu nebo druhého polymerového roztoku do polymerového lešení; po stabilizaci tvaru hlavního polymeru je jehla, drát nebo druhý polymer odstraněn za účelem vytvoření kanálů. Obvykle je vytvořeno více kanálů; lešení se však může skládat pouze z jednoho velkého kanálu, kterým je jednoduše jedna dutá trubice.
Wang a kol. vytvořili techniku formování vedení nervů s vícekanálovou vnitřní matricí a vnější stěnou trubice z chitosanu. Ve své studii z roku 2006 Wang a kol. protáhli akupunkturní jehly dutou chitosanovou trubicí, kde jsou drženy na místě fixací na obou koncích náplastí vytvořených pomocí CAD. Do trubice je pak vstříknut roztok chitosanu a zpevněn, po kterém jsou jehly odstraněny a vytvořeny podélně orientované kanály. Pro charakterizaci s 21 kanály bylo vytvořeno reprezentativní lešení s použitím akupunkturních jehel o průměru 400 µm. Při zkoumání pod mikroskopem bylo zjištěno, že kanály jsou přibližně kruhové s mírnými nepravidelnostmi; všechny kanály byly zarovnány s vnitřním průměrem vnější stěny trubice. Bylo potvrzeno mikro-CT zobrazováním, že kanály procházely celou délkou lešení. Při absorpci vody se vnitřní a vnější průměry lešení zvětšovaly, ale průměry kanálů se výrazně neměnily, což je nezbytné pro zachování tvaru lešení, které vede prodloužení neuritu. Vnitřní struktura poskytuje zvýšení pevnosti v tlaku ve srovnání se samotnou dutou trubicí, což může zabránit zhroucení lešení na rostoucí neurity. Neuro-2a buňky byly schopny růst na vnitřní matrici lešení a orientovaly se podél kanálů. Ačkoli tato metoda byla testována pouze na chitosanu, může být přizpůsobena jiným materiálům.
Proces lyofilizace a zahřívání drátů je další metodou vytváření podélně orientovaných kanálů, kterou vyvinuli Huang a kol. (2005). Kolem nikl-měděných (Ni-Cu) drátů byl zmražen roztok chitosanu a kyseliny octové v lapači kapalného dusíku; následně byly dráty zahřáty a odstraněny. Ni-Cu dráty byly zvoleny, protože mají vysokou úroveň odolnosti. K sublimaci kyseliny octové byly použity teplotou řízené lyofilizátory. Nebyly nalezeny žádné důkazy o slučování nebo štěpení kanálů. Po lyofilizaci se zmenšily rozměry lešení, což způsobilo, že kanály byly o něco menší než použitý drát. Lešení byla neutralizována na fyziologickou hodnotu pH pomocí báze, což mělo dramatické účinky na pórovitou strukturu. Slabší báze udržovaly pórovitou strukturu rovnoměrnou, ale silnější báze ji činila neovladatelnou. Zde použitá technika může být mírně upravena tak, aby vyhovovala jiným polymerům a rozpouštědlům.
Dalším způsobem, jak vytvořit podélně orientované kanály, je vytvořit potrubí z jednoho polymeru s vloženými podélně orientovanými vlákny z jiného polymeru; poté vlákna selektivně rozpustit a vytvořit podélně orientované kanály. Vlákna z polykaprolaktonu (PCL) byla vložena do (hydroxyethyl)methakrylátového (HEMA) lešení. PCL byla zvolena místo poly (kyselina mléčná) (PLA) a poly (kyselina mléčná-ko-glykolová) (PLGA), protože je nerozpustná v HEMA, ale rozpustná v acetonu. To je důležité, protože HEMA byla použita pro hlavní materiál potrubí a aceton byl použit k selektivnímu rozpuštění polymerních vláken. Vytlačená PCL vlákna byla vložena do skleněné trubice a roztok HEMA byl vstříknut. Počet vytvořených kanálů byl konzistentní od šarže k šarži a rozdíly v průměru vláken mohly být sníženy vytvořením kontrolovanějšího systému vytlačování PCL vláken. Vytvořené kanály byly potvrzeny jako spojité a homogenní zkoumáním změn pórovitosti. Tento proces je bezpečný, reprodukovatelný a má regulovatelné rozměry. V podobné studii, kterou provedli Yu a Shoichet (2005), byla HEMA kopolymerizována s AEMA za účelem vytvoření P(HEMA-co-AMEA) gelu. Do gelu byla vložena polykaprolaktonová (PCL) vlákna a poté selektivně rozpuštěna acetonem se sonifikací za účelem vytvoření kanálů. Bylo zjištěno, že HEMA ve směsi s 1% AEMA vytvořila nejsilnější gely. Ve srovnání s lešeními bez kanálů může přidání 82-132 kanálů poskytnout přibližně 6-9násobné zvětšení plochy, což může být výhodné pro regenerační studie, které jsou závislé na kontaktem zprostředkovaných podnětech.
Itoh a kol. (2003) vyvinuli lešení sestávající z jednoho velkého podélně orientovaného kanálu, který byl vytvořen pomocí chitosanových šlach z krabů. Šlachy byly sklizeny z krabů (Macrocheira kaempferi) a opakovaně omývány roztokem hydroxidu sodného, aby se odstranily bílkoviny a deacetyloval šlachový chitin, který se následně stal známý jako tendon chitosan. Do duté šlachovité chitosanové trubice kruhového průřezu (průměr: 2 mm; délka: 15 mm) byla vložena nerezová tyč s průřezem trojúhelníkového tvaru (každá strana 2,1 mm). Při porovnání trubic kruhového a trojúhelníkového tvaru bylo zjištěno, že trojúhelníkové trubice zlepšily mechanickou pevnost, lépe držely svůj tvar a zvětšovaly dostupnou plochu. I když je to efektivní metoda pro vytvoření jednoho kanálu, neposkytuje tolik plochy pro buněčný růst jako vícekanálové lešení.
Podélně orientovaná vlákna
Kromě podélně orientovaných kanálů lze podélně orientovaná vlákna přidávat také do potrubí, aby regenerační axony měly vodítko pro podélně orientovaný růst. Studie provedené Newmanem a kol. (2006) a Caiem a kol. (2005) ukázaly, že přidávání vláken do lešení podporuje vnitřní kontaktní vedení a zvyšuje propustnost pro lepší výměnu živin a odpadů tak, že lešení má lepší výkon při opravě nervů oproti nepropustným potrubím, kterým chybí vlákna.
Newman a kol. (2006) vložili vodivá a nevodivá vlákna do kolagenového lešení TERP (kolagen křížený s terpolymerem poly(N-isopropylakrylamidu) (PNiPAAm) ). Vlákna byla zalita těsným obalením na malé skleněné podložce a vložením roztoku kolagenu-TERP mezi ni a další skleněnou podložku; rozpěrky mezi skleněnými podložkami nastavily tloušťku gelu na 800 µm. Vodivá vlákna byla z uhlíkových vláken a kevlaru a nevodivá vlákna z nylonu-6 a wolframového drátu. Neurity se rozprostírají všemi směry v silných svazcích na uhlíkovém vlákně; s ostatními třemi vlákny se však neurity rozšířily v jemných pavučinových konformacích. Neurity nevykazovaly žádný směrový růst na uhlíkových a kevlarových vláknech, ale rostly podél vláken z nylonu-6 a do jisté míry i podél wolframového drátu. Na wolframovém drátu a na lešení z nylonu-6 vláken rostly neurity do gelu poblíž rozhraní vlákno-gel, kromě toho rostly podél povrchu. Všechny vláknové gely kromě kevlaru vykazovaly výrazný nárůst neuritového prodloužení ve srovnání s nevlákennými gely. Nebyl žádný rozdíl v neuritovém prodloužení mezi nevodivými a vodivými vlákny.
Ve své studii z roku 2005 Cai a kol. přidávali poly (kyselina L-mléčná) (PLLA) mikrovlákna do dutých poly(kyselina mléčná) (PLA) a křemíkových trubic. Vlastnosti vedení mikrovlákna byly nepřímo úměrné průměru vlákna s menšími průměry podporujícími lépe podélně orientovanou migraci buněk a axonální regeneraci. Mikrovlna také podporovala myelinizaci během opravy periferních nervů.
Bylo prokázáno, že zralé axonové trakty zažívají růst při mechanickém protažení ve střední části axonového válce. Takovéto mechanické protažení bylo aplikováno vlastním axonovým stretch-growth bioreaktorem složeným ze čtyř hlavních komponent: na zakázku konstruované axonové expanzní komory, lineárního pohybového stolu, krokového motoru a ovladače. Kultivace nervové tkáně je umístěna uvnitř expanzní komory s otvorem pro výměnu plynu a odnímatelným stretching rámem, který je schopen oddělit dvě skupiny som (těla neuronových buněk) a tím protáhnout jejich axony. Kolagenový gel byl použit k podpoře růstu větších stretch-grown axonových traktů, které byly viditelné pouhým okem. Existují dva důvody pro posílení růstu díky kolagenovému povlaku: 1) kultura se stala hydrofobní po vysušení kolagenu, což umožnilo růst hustší koncentrace neuronů, a 2) kolagenový povlak vytvořil nerušený povlak přes oba protahovací substráty. Vyšetření pomocí skenovacího elektronového mikroskopu a TEM neukázalo žádné známky ztenčení axonu v důsledku strečování a cytoskelet se zdál být normální a neporušený. Strečové axonové trakty byly kultivovány na biokompatibilní membráně, která mohla být přímo zformována do válcové struktury pro transplantaci, čímž se eliminovala nutnost přenášet axony po dokončení růstu na lešení. Strečové axony byly schopny růst nebývalou rychlostí 1 cm/den již po 8 dnech aklimatizace, což je mnohem více než maximální rychlost růstu 1 mm/den měřená pro prodloužení růstového kužele. Rychlost 1 mm/den je také průměrnou rychlostí transportu strukturálních prvků, jako jsou neurofilamenty.
Výzkum vláken v nanoměřítku se pokouší napodobit strukturu kolagenu v extracelulární matrici vytvořením vláken, která se přibližují průměru přírodních kolagenových svazků v nanoměřítku. Tři odlišné metody pro vytváření nanovlákenných lešení jsou samomontáž, fázová separace a elektrospinning. Existuje však mnoho dalších metod pro vytváření nanovlákenných lešení.
Samostatná montáž nanovlákenných lešení může nastat pouze tehdy, když jsou samotná vlákna konstruována pro samomontáž. Jedním z běžných způsobů, jak řídit samomontáž vláken lešení, je použití amfifilních peptidů tak, aby ve vodě hydrofobní část poháněla samomontáž. Pečlivě vypočítané inženýrství amfifilních peptidů umožňuje přesnou kontrolu nad samosestavenou matricí. Samostatná montáž je schopna vytvořit uspořádané i neuspořádané topografie. Phillips a kol. (2005) vyvinuli a testovali in vitro a in vivo samouspořádanou kolagenově-Schwannovu buněčnou matrici, která umožnila zarovnání neuritového prodloužení DRG in vitro. Kolagenové gely byly hojně používány jako substráty pro trojrozměrnou tkáňovou kulturu. Buňky jsou schopny vytvořit integrinem zprostředkované vazby s kolagenem, což iniciuje sestavení cytoskeletu a buněčnou motilitu. Jak se buňky pohybují podél kolagenových vláken, vytvářejí síly, které stahují gel. Když jsou kolagenová vlákna uvázána na obou koncích, buněčné síly vytvářejí jednoosé napětí, což způsobuje, že se buňky a kolagenová vlákna vyrovnávají. Výhodou této matrice je její jednoduchost a rychlost přípravy. Rozpustný plazmový fibronektin se také může samouspořádáním vytvořit stabilní nerozpustná vlákna, když je umístěn pod přímým mechanickým střihem v viskózním roztoku. Phillips a kol. (2004) zkoumali novou metodu střihové agregace, která způsobuje zlepšenou agregaci. Mechanické střihnutí bylo vytvořeno protažením 0,2 ml bolusu do 3 cm kleštěmi; fibronektin se agreguje do nerozpustných vláken na rychle se pohybujícím rozhraní v ultrafiltrační buňce. Navrhovaným mechanismem pro tuto agregaci vláken je prodloužení proteinu a prodloužení pod mechanickou střihovou silou, což vede k bočnímu obalení a agregaci proteinů vláken. Phillips a kol. ukázali, že mechanický střih vzniklý natažením fibronektinového gelu s vysokou viskozitou způsobuje podstatné změny v jeho struktuře a že při aplikaci uniaxiálním protažením tvoří viskózní fibronektinový gel orientované fibronektinové agregáty; navíc mají vláknité agregáty sníženou rozpustnost a mohou podporovat různé typy buněk in vitro.
Fázová separace umožňuje vytvořit trojrozměrné submikrometrové vláknové lešení bez použití specializovaných zařízení. Pět kroků, které se podílejí na fázové separaci, jsou rozpouštění polymeru, fázová separace a gelace, extrakce rozpouštědla z gelu, zmrazení a zmrazení sušení ve vodě. Konečným produktem je souvislá vláknová síť. Fázovou separaci lze upravit tak, aby vyhovovala mnoha různým aplikacím, a strukturu pórů lze měnit pomocí různých rozpouštědel, která mohou změnit celý proces z kapalino-kapalné na pevno-kapalné. Pórovitost a průměr vlákna lze také upravit změnou počáteční koncentrace polymeru; vyšší počáteční koncentrace vede k menšímu počtu pórů a většímu průměru vlákna. Tato technika může být použita k vytvoření sítí vláken s průměry dosahujícími průměrů kolagenových vláken typu I. Vytvořená vláknová síť je náhodně orientovaná a dosud se nepracovalo na pokusech o uspořádání vláken. Fázová separace je široce používaná technika pro snadné vytvoření vysoce porézních nanovláknitých lešení.
Elektrospinný proces vytváří nanovlákna tím, že elektricky nabíjí kapičku polymerové taveniny nebo roztoku a suspenduje ji z kapiláry. Poté se na jednom konci kapiláry aplikuje elektrické pole, dokud náboj nepřekročí povrchové napětí, čímž se vytvoří polymerová tryska, která se prodlužuje a ztenčuje. Elektricky nabité polymery zůstávají pozadu, protože rozpouštědlo se odpařuje z trysek a shromažďuje se na uzemněném povrchu. Vlákna byla spředena s průměry od méně než 3 nm do více než 1 µm. Proces je ovlivněn systémovými parametry, jako je molekulová hmotnost polymeru a vlastnosti roztoku a procesními parametry, jako je průtok, vzdálenost mezi kolektorem a kapilárou a pohyb kolektoru. Elektrospinný proces tvoří vlákna s regulovatelnými průměry a zarovnáním. Vytvořená vláknitá síť je neuspořádaná a obsahuje vysoký poměr plochy k objemu v důsledku vysoké pórovitosti; velká plocha povrchu sítě je ideální pro růst a přepravu odpadů a živin v inženýrství nervové tkáně. Dvěma vlastnostmi elektrospunových lešení, které jsou výhodné pro inženýrství nervové tkáně, jsou morfologie a architektura, která věrně napodobuje ECM, a póry, což je správný rozsah velikostí, který umožňuje výměnu živin, ale zabraňuje růstu jizevnaté tkáně (kolem 10 µm). Bylo prokázáno, že náhodná elektrospunová PLLA lešení mají zvýšenou adhezi buněk, což může být způsobeno zvýšenou drsností povrchu. Elektrospunové vláknové sítě mohou být také objednány a použity k prezentaci zarovnávacích podnětů buňkám; to je výhodné, protože velká měřítka trojrozměrných zarovnaných lešení nemohou být vytvořena snadno pomocí makrovýrobních technik. Ve studii provedené Yangem a kol. (2005) byla vytvořena, charakterizována a porovnána zarovnaná a náhodná elektronová poly (kyselina L-mléčná) (PLLA) mikrovláknitá a nanovláknitá lešení. Průměry vláken byly přímo úměrné počáteční koncentraci polymeru použitého pro eletrospinning; průměrný průměr zarovnaných vláken byl menší než průměr náhodných vláken za identických podmínek zpracování. Bylo prokázáno, že neuronové kmenové buňky se protáhly paralelně s zarovnanými elektronovými vlákny. Zarovnaná nanovlákna měla delší průměrnou délku neuritu ve srovnání s zarovnanými mikrovlákny, náhodnými mikrovlákny a náhodnými nanovlákny. Navíc se více buněk odlišovalo na zarovnaných nanovláknech než zarovnaných mikrovláknech. Zarovnaná nanovlákna jsou tedy prospěšnější než neurčitá vlákna a mikrovlákna pro podporu nervové regenerace.
Mikrostruktura a nanostruktura
Mikrostruktura a nanostruktura jsou spolu s nástavbou tři hlavní úrovně struktury lešení, které si zaslouží pozornost při vytváření topografie lešení. Zatímco nástavba odkazuje na celkový tvar lešení, mikrostruktura odkazuje na strukturu buněčné úrovně povrchu a nanostruktura odkazuje na strukturu podbuněčné úrovně povrchu. Mikrostruktura a nanostruktura byly hlavním zájmem nedávného výzkumu, ale dosud neexistuje mnoho zavedených metod pro modifikaci struktury v nanoměřítku. Nedávno došlo ke změně zájmu z mikroměřítka na nanoměřítko motivované četnými strukturami v nanoměřítku ECM. Chemické i fyzikální podněty mohou být použity k řízení růstu buněk.
Fyzické podněty vznikají vytvořením uspořádané povrchové struktury na úrovni mikrostruktury a nanostruktury. Bylo prokázáno, že samotné fyzické podněty mají významný vliv na buněčnou organizaci v kultuře; tato vlastnost fyzického vedení je známá jako kontaktní vedení. Existuje mnoho metod pro vytváření fyzických topografií; lze je rozdělit na ty, které vytvářejí uspořádané topografie, a na ty, které vytvářejí neuspořádané topografie.
Řazené topografie jsou definovány jako obrazce, které jsou uspořádané a geometricky přesné. Ačkoliv existuje mnoho metod pro vytváření uspořádaných topografií, jsou obvykle časově náročné, vyžadují zručnost a zkušenosti a použití drahého vybavení.
V elektronové litografii (EBL) je elektron-citlivý odpor vystaven paprsku vysokoenergetických elektronů. Je zde možnost volby kladného nebo záporného typu odporu, nicméně nižší rozlišení rysů lze dosáhnout pomocí záporných odporů. Vzory jsou vytvořeny naprogramováním paprsku elektronů pro přesnou dráhu, která má následovat po povrchu materiálu. Rozlišení je ovlivněno dalšími faktory, jako je rozptyl elektronů v odporu a zpětný rozptyl ze substrátu. EBL může vytvořit jednotlivé povrchové rysy v řádu 3–5 nm. Pokud je vyžadováno více rysů na velké ploše, jako je tomu v tkáňovém inženýrství, rozlišení klesá a rysy mohou být vytvořeny pouze v rozsahu 30–40 nm, a vývoj odporu začíná zatěžovat tvorbu vzoru více. Aby se zabránilo rozpuštění odporu, lze využít ultrazvukové agitace k překonání intermolekulárních sil. Kromě toho isopropylalkohol (IPA) pomáhá vytvářet pole s vysokou hustotou. EBL se může stát rychlejším a méně nákladným procesem replikací nanometrových patterů v polymerních materiálech; proces replikace byl demonstrován s polykaprolaktonem (PCL) pomocí horkého embosování a rozpouštědlového lití. Ve studii provedené Gomezem a kol. (2007) bylo prokázáno, že mikrokanály 1 a 2 µm široké a 400 a 800 nm hluboké vytvořené EBL na PDMS zvyšují tvorbu axonů hipokampálních buněk v kultuře více než imobilizované chemické podněty.
Rentgenová litografie je další metodou pro vytváření uspořádaných obrazců, kterou lze použít k prozkoumání role, kterou topografie hraje při podpoře neuritogeneze. Parametry masky určují periodicitu obrazce, ale šířka a hloubka hřebenu jsou dány podmínkami leptání. Ve studii byly vytvořeny hřebeny s periodami od 400 do 4000 nm, šířkami od 70 do 1900 nm a hloubkou drážky 600 nm; vyvíjející se neurity prokázaly kontaktní vedení s rysy malými jako 70 nm a více než 90% neuritů bylo v rozmezí 10 stupňů paralelního vyrovnání s hřebeny a drážkami. Nebyl významný rozdíl v orientaci vzhledem k použitým velikostem rysů. Počet neuritů na buňku byl omezen hřebeny a drážkami, což vedlo spíše k bipolárním než rozvětveným fenotypům.
Nespořádané topografie jsou obecně vytvářeny procesy, které se vyskytují spontánně během jiného zpracování; vzory jsou náhodné v orientaci a organizaci s nepřesnou nebo žádnou kontrolou nad geometrií prvků. Výhodou vytváření neuspořádaných topografií oproti uspořádaným je, že procesy jsou často méně časově náročné, méně nákladné a nevyžadují velkou zručnost a zkušenost. Nespořádané topografie mohou být vytvářeny polymerovým demixingem, koloidní litografií a chemickým leptáním.
Při polymerním demixingu dochází u polymerních směsí k samovolnému fázovému oddělení; často k němu dochází za podmínek, jako je spinové odlévání na křemíkové destičky. Mezi vlastnosti, které lze touto metodou vytvořit, patří jámy, ostrůvky a stuhy v nanoměřítku, které lze do určité míry ovládat úpravou poměru a koncentrace polymeru, aby se změnil tvar a velikost rysu, respektive. V horizontálním směru není mnoho ovládání, i když vertikální směr rysů lze přesně ovládat. Vzhledem k tomu, že vzorec je horizontálně velmi neuspořádaný, lze tuto metodu použít pouze ke studiu interakcí buněk se specifickými výškovými nanotopografiemi.
Koloidní litografie je nenákladná a lze ji použít k vytvoření povrchů s kontrolovanou výškou a průměrem. Nanokoloidy se používají jako leptaná maska tím, že se rozprostírají po povrchu materiálu, a pak se iontové bombardování nebo odpařování filmu používá k leptání kolem nanokolizí, čímž se vytvářejí nanokolony, respektive nanodůlky. Konečnou strukturu povrchu lze ovládat změnou plochy pokryté koloidy a velikosti koloidů. Plochu pokrytou koloidy lze změnit úpravou iontové síly koloidního roztoku. Tato technika je schopna vytvořit velké vzorované plochy povrchu, což je nezbytné pro aplikace tkáňového inženýrství.
Chemické leptání zahrnuje namáčení povrchu materiálu v leptu, jako je kyselina fluorovodíková (HF) nebo hydroxid sodný (NaOH), dokud není povrch vyleptán na požadovanou drsnost, jak ji vytvářejí důlky a výčnělky v nanometrové škále. Delší doba leptání vede k drsnějším povrchům (tj. menším povrchovým důlkům a výčnělkům). Struktury se specifickou geometrií nebo organizací nelze touto základní metodou vytvořit, protože v nejlepším případě ji lze považovat za povrchovou úpravu pro změnu drsnosti povrchu. Významnými výhodami této metody jsou snadnost použití a nízké náklady na vytvoření povrchu s nanotopografiemi. Křemíkové destičky byly vyleptávány pomocí HF a bylo prokázáno, že přilnavost buněk byla zvýšena pouze ve stanoveném rozsahu drsnosti (20–50 nm).
Kromě vytváření topografie s fyzikálními podněty, může být vytvořena s chemickými podněty selektivním nanášením polymerního roztoku do obrazců na povrchu substrátu. Existují různé metody pro nanášení chemických podnětů. Dvě metody pro dávkování chemických roztoků zahrnují vzorování pruhů a piezoelektrické mikrodávkování.
Polymerní fólie s pruhovaným vzorem mohou být vytvořeny na pevných podkladech odléváním zředěného polymerního roztoku. Tato metoda je relativně snadná, nenákladná a nemá žádné omezení materiálů lešení, které lze použít. Postup spočívá v horizontálním překrývání skleněných desek, přičemž je držíme svisle oddělené úzkou mezerou vyplněnou polymerním roztokem. Horní deska se pohybuje konstantní rychlostí mezi 60 až 100 µm/s. Po odpaření rozpouštědla se na okraji posuvného skla průběžně tvoří tenký tekutý film roztoku. Pruhované vzory připravené při rychlostech 60, 70 a 100 µm/s vytvořily šířkové a drážkové rozestupy 2,2 a 6,1 µm, 3,6 a 8,4 µm a 4,3 a 12,7 µm; rozsah výšek pro hřebeny byl 50–100 nm. Tsuruma, Tanaka a kol. prokázali, že embryonální nervové buňky kultivované na filmu potaženém připojeným poly-L-lysinem a protáhlým rovnoběžně s poly(ε-kaprolaktonem)/chloroformovým roztokem (1g/L) proužky s úzkou šířkou a rozestupy vzoru (šířka: 2,2 µm, rozestupy: 6,1 µm). Neurony však rostly napříč osou vzorů se širokou šířkou a rozestupy (šířka: 4,3 µm, rozestupy: 12,7 µm). V průměru měly neurony na proužkových filmech méně neuritů na buňku a delší neurity ve srovnání s neurony na neformátovaných filmech. Parametry proužkového vzoru jsou tedy schopny určit směr růstu, délku neuritů a počet neuritů na buňku.
Mikrodávka se používala k vytváření mikroobrazců na polystyrenových kultivačních miskách dávkováním kapiček adhezivního lamininu a nepřilnavých roztoků bovinního sérového albuminu (BSA). Mikrodávka je piezoelektrický prvek připojený k přítlačné tyči na horní straně kanálu vyleptaného do křemíku, který má na každém konci jeden vstup a uprostřed trysku. Piezoelektrický prvek se při použití napětí roztahuje, což způsobuje, že se kapalina dávkuje tryskou. Mikrodávka se pohybuje pomocí počítačem řízené x-y tabulky. Rozlišení mikroobrazce závisí na mnoha faktorech: viskozita dávkované kapaliny, výška kapky (vzdálenost mezi středem dvou sousedních kapiček v lince nebo poli) a substrát. Se zvyšující se viskozitou se linky ztenčují, ale pokud je viskozita kapaliny příliš vysoká, kapalinu nelze vytlačit. Zahříváním roztoku se vytváří rovnoměrnější proteinové linky. Ačkoli je pro vytvoření souvislých přímek nutné určité překrytí kapiček, nerovnoměrné odpařování může způsobit nerovnoměrnou koncentraci proteinů podél přímek; tomu lze zabránit plynulejším odpařováním úpravou vlastností dávkovaného roztoku.
U obrazců obsahujících 0,5 mg/ml lamininu rostl na mikrodávkovaných linkách vyšší podíl neuritů než mezi linkami. Na vzorcích proteinů BSA o koncentraci 10 mg/ml a 1 mg/ml a vzorcích proteinů BSA bez mastných kyselin se značný počet neuritů vyhýbal proteinovým linkám a rostl mezi linkami. Tudíž linky BSA s obsahem mastných kyselin byly pro růst neuritů stejně nevýhodné jako linky obsahující BSA s mastnými kyselinami. Protože mikrodávkování nevyžaduje přímý kontakt s povrchy substrátu, může tato technika využít povrchy s jemnou mikro- nebo nanotopologií, které by mohly být zničeny kontaktem. Je možné měnit množství uloženého proteinu dávkováním více či méně kapiček. Výhodou mikrodávkování je, že obrazce lze vytvořit rychle za 5–10 minut. Protože piezoelektrický mikrodávkovač nevyžaduje zahřívání, lze dávkovat tepelně citlivé proteiny a tekutiny i živé buňky.
Výběr materiálu lešení je asi tím nejdůležitějším rozhodnutím, které je třeba učinit. Musí být biologicky kompatibilní a biologicky rozložitelný; kromě toho musí být schopen včlenit jakékoli fyzikální, chemické nebo biologické podněty, které jsou žádoucí, což v případě některých chemických podnětů znamená, že musí mít k dispozici místo pro chemicky spojující peptidy a jiné molekuly. Materiály lešení, které se volí pro vedení nervových spojů, jsou téměř vždy hydrogely. Hydrogel může být složen buď z biologických, nebo ze syntetických polymerů. Biologické i syntetické polymery mají své silné a slabé stránky. Je důležité poznamenat, že materiál potrubí může způsobit nedostatečnou regeneraci, pokud (1) rychlost degradace a resorpce neodpovídají rychlosti tvorby tkáně, (2) vlastnosti stresové zátěže se nevyrovnají vlastnostem nervové tkáně, (3) dojde-li k degradačnímu otoku, který způsobí významnou deformaci, (4) je vyvolána velká zánětlivá reakce nebo (5) materiál má nízkou propustnost.
Hydrogely jsou třídou biomateriálů, které jsou chemicky nebo fyzikálně propojenými polymery rozpustnými ve vodě. Mohou být buď rozložitelné, nebo nerozložitelné, jak určuje jejich chemie, ale rozložitelné jsou žádoucí všude, kde je to možné. Velký zájem byl o hydrogely pro účely tkáňového inženýrství, protože mají obecně vysokou biologickou kompatibilitu, mechanické vlastnosti podobné měkkým tkáním a schopnost být vstříknuty jako kapalina, která geluje. Když jsou hydrogely fyzicky propojené, musí se spoléhat na fázovou separaci pro gelaci; fázová separace je závislá na teplotě a vratná. Některé další výhody hydrogelů jsou, že používají pouze netoxická vodná rozpouštědla, umožňují infuzi živin a únik odpadních produktů a umožňují buňkám spontánní kompletaci. Hydrogely mají nízké interfaciální napětí, což znamená, že buňky mohou snadno migrovat přes hranici tkáně a implantátu. U hydrogelů je však obtížné vytvořit širokou škálu mechanických vlastností nebo struktur s kontrolovanou velikostí pórů.
Syntetický polymer může být nerozložitelný nebo rozložitelný. Pro účely inženýrství nervové tkáně jsou preferovány pokud možno rozložitelné materiály, protože dlouhodobé účinky jako zánět a jizva by mohly vážně poškodit funkci nervů. Rychlost odbourávání je závislá na molekulární hmotnosti polymeru, jeho krystaličnosti a poměru kyseliny glykolové a podjednotek kyseliny mléčné. Vzhledem k methylové skupině je kyselina mléčná hydrofobnější než kyselina glykolová, což způsobuje její pomalejší hydrolýzu. Syntetické polymery mají více užitných mechanických vlastností a rychlosti odbourávání, které mohou být kontrolovány v širokém rozsahu, a eliminují obavy z imunogenity. V současné době se v inženýrství nervové tkáně používá mnoho různých syntetických polymerů. Nevýhodou mnoha těchto polymerů je však nedostatečná biokompatibilita a bioaktivita, která zabraňuje těmto polymerům v podpoře buněčného připoutání, proliferace a diferenciace. Syntetické spoje byly klinicky úspěšné pouze při opravě velmi krátkých mezer nervových lézí menších než 1-2 cm. Navíc nervová regenerace s těmito spoji ještě nedosáhla úrovně funkčního zotavení pozorované u nervových autograftů.
Poly (kyselina mléčná-ko-glykolová) čeleď
Polymery z rodiny PLGA zahrnují poly (kyselinu mléčnou) (PLA), poly (kyselinu glykolovou) (PGA) a jejich kopolymer poly (kyselinu mléčnou-koglykolovou) (PLGA). Všechny tři polymery byly schváleny Úřadem pro kontrolu potravin a léčiv pro použití v různých zařízeních. Tyto polymery jsou křehké a nemají oblasti pro povolenou chemickou modifikaci; navíc se rozkládají spíše hromadně než povrchově, což není hladký a ideální proces rozkladu. Ve snaze překonat nedostatek funkčnosti byly do jejich struktur začleněny volné aminy, ze kterých mohou být uvázány peptidy pro kontrolu vazby a chování buněk.
Metakrylovaný dextran (Dex-MA) kopolymerizovaný s aminoethylmethakrylátem (AEMA)
Dextran je polysacharid odvozený od bakterií; obvykle je produkován enzymy z určitých kmenů leukonostoku nebo Streptococcusu. Skládá se ze zbytků α-1,6-vázané D-glukopyranosy. Zesítěné hydrogelové kuličky dextranu byly široce používány jako matrice s nízkou vazbou bílkovin pro aplikace kolonové chromatografie a pro technologii mikronosičových buněčných kultur. Až donedávna však nebyly hydrogely dextranu zkoumány v aplikacích pro biomateriály a konkrétně jako nosiče léků. Výhodou použití dextranu v aplikacích pro biomateriály je jeho odolnost vůči adsorpci bílkovin a buněčné adhezi, která umožňuje určit specifickou buněčnou adhezi pomocí záměrně navázaných peptidů ze složek ECM. AEMA byla kopolymerizována s Dex-MA s cílem zavést primární aminové skupiny, které poskytnou místo pro navázání peptidů odvozených od ECM na podporu buněčné adheze. Peptidy mohou být imobilizovány pomocí sulfo-SMMC vazebné chemie a peptidů zakončených cysteinem. Kopolymerizace Dex-MA s AEMA umožnila kromě podpory buněčných interakcí zachovat makroporézní geometrii lešení.
Poly(glycerol-sebakát) (PGS)
Z poly(glycerol-sebakátu) (PGS) byl vyvinut nový biologicky rozložitelný, houževnatý elastomer pro použití při vytváření vodicího vedení nervu. PGS byl původně vyvinut pro účely inženýrství měkkých tkání, aby specificky napodoboval mechanické vlastnosti ECM. Je považován za elastomer, protože je schopen se zotavit z deformace v mechanicky dynamickém prostředí a efektivně rovnoměrně distribuovat stres do regenerujících se tkání ve formě mikrostresu. PGS je syntetizován polykondenzační reakcí glycerolu a kyseliny sebakové, které mohou být roztaveny nebo rozpouštědlem zpracovány do požadovaného tvaru. PGS má Youngův modul 0,28 MPa a konečnou pevnost v tahu větší než 0,5 MPa. Periferní nerv má Youngův modul přibližně 0,45 MPa, což je velmi blízko PGS. Navíc PGS zažívá povrchovou degradaci doprovázenou ztrátami lineární hmoty a pevnosti během resorpce. Po implantaci byl stanoven poločas degradace na 21 dní; úplná degradace nastala v 60. dni. PGS zaznamenává během degradace minimální absorpci vody a nemá zjistitelný otok; otok může způsobit distorzi, která zužuje tubulární lumen a může bránit regeneraci. Je výhodné, že doba degradace PGS se může měnit změnou stupně křížení a poměru kyseliny sebakové ke glycerolu. Ve studii společnosti Sundback a kol. (2005) měly implantované PGS a PLGA vodiče podobné časné reakce tkáně; nicméně zánětlivé reakce PLGA se vyšplhaly později, zatímco zánětlivé reakce PGS nadále klesaly.
Polyethylenglykol hydrogel
Hydrogely z polyethylenglykolu (PEG) jsou biokompatibilní a je prokázáno, že jsou tolerovány v mnoha typech tkání, včetně CNS. Mahoney a Anseth vytvářeli PEG hydrogely fotopolymerizací methakrylátových skupin kovalentně vázaných na rozložitelné PEG makromery. Degradace vodíku byla sledována v průběhu času měřením mechanické pevnosti (kompresní modul) a průměrné velikosti ok z údajů o poměru otoků. Zpočátku byly polymerové řetězce vysoce křížově propojeny, ale jak degradace probíhala, esterové vazby byly hydrolyzovány, což umožnilo gelu bobtnat; kompresní modul se snižoval, jak se velikost ok zvětšovala, až byl hydrogel zcela rozpuštěn. Bylo prokázáno, že nervové prekurzorové buňky byly schopny fotozapouzdřit a kultivovat na PEG gelech s minimální buněčnou smrtí. Protože velikost ok je zpočátku malá, hydrogel blokuje zánětlivé a jiné inhibiční signály z okolní tkáně. Jak se velikost ok zvětšuje, hydrogel je schopen sloužit jako lešení pro regeneraci axonu.
Použití biologických polymerů oproti syntetickým polymerům má své výhody. Je velmi pravděpodobné, že budou mít dobrou biologickou kompatibilitu a budou snadno degradovatelné, protože jsou již v přírodě v nějaké formě přítomny. Má to však také několik nevýhod. Mají nepraktické mechanické vlastnosti a rychlost rozkladu, které nelze regulovat v širokém rozsahu. Navíc je zde vždy možnost, že materiály pocházející z přírody mohou vyvolat imunitní reakci nebo obsahovat mikroby. Při výrobě materiálů pocházejících z přírody bude také docházet k dávkovým odchylkám ve velkých izolačních postupech, které nelze regulovat. Některé další problémy, které trápí přírodní polymery, jsou jejich neschopnost podporovat růst v dlouhých mezerách lézí kvůli možnosti kolapsu, tvorbě jizev a včasné zpětné absorpci. Přes všechny tyto nevýhody, z nichž některé lze překonat, se biologické polymery v mnoha situacích stále ukazují jako optimální volba.
Kyselina polysialová (PSA) je relativně nový biokompatibilní a bioresorbovatelný materiál pro umělé nervové spoje. Je to homopolymer α2,8-vázaných zbytků kyseliny sialové a dynamicky regulovaná posttranslační modifikace adhezní molekuly nervové buňky (NCAM). Nedávné studie prokázaly, že polysialylovaná NCAM (polySia-NCAM) podporuje regeneraci v motorickém systému. PSA vykazuje stabilitu za podmínek buněčné kultury a umožňuje indukovanou degradaci enzymy. Nedávno bylo také zjištěno, že PSA se podílí na procesech řízení, jako je neuritogeneze, hledání axonální dráhy a migrace neuroblastů. Zvířata s PSA geneticky vyřazeným exprimují smrtící fenotyp, který má neúspěšné hledání dráhy; nervy spojující obě mozkové hemisféry byly aberantní nebo chyběly. PSA je tedy životně důležitá pro správný vývoj nervového systému.
Kolagen je hlavní složkou extracelulární matrice a byl široce používán při regeneraci a opravách nervů. Díky své hladké mikrogeometrii a propustnosti jsou kolagenové gely schopny umožnit difúzi molekul jejich prostřednictvím. Rychlost resorpce kolagenu je možné kontrolovat křížovým propojením kolagenu s polypoxylovými sloučeninami. Navíc kolagenové lešení typu I/III prokázalo dobrou biologickou kompatibilitu a je schopno podporovat proliferaci Schwannových buněk. Kolagenové spoje naplněné Schwannovými buňkami, které se používají k přemostění nervových mezer u potkanů, však prokázaly překvapivě neúspěšnou regeneraci nervů ve srovnání s nervovými autografty. Je to proto, že biologická kompatibilita není jediným faktorem nezbytným pro úspěšnou regeneraci nervů; další parametry, jako je vnitřní průměr, vnitřní mikrotopografie, pórovitost, tloušťka stěny a hustota osázení Schwannových buněk, budou muset být zkoumány v budoucích studiích, aby se zlepšily výsledky získané těmito kolagenovými gely I/III.
Je prokázáno, že pavoučí hedvábná vlákna podporují buněčnou přilnavost, proliferaci a vitalitu. Allmeling, Jokuszies et al. ukázali, že Schwannovy buňky se rychle a pevně vážou na hedvábná vlákna, rostou v bipolárním tvaru; proliferace a míra přežití byly u hedvábných vláken normální.
Používali vlákna pavoučího hedvábí k vytvoření nervového spoje se Schwannovými buňkami a acelularizovanými xenogenními žílami. Schwannovy buňky vytvořily v krátkém čase podél hedvábných vláken sloupce a sloupce byly podobné Bungnerovým pásům, které rostou in vivo po zranění PNS. Pavoučí hedvábí se dosud v tkáňovém inženýrství nepoužívalo kvůli predátorské povaze pavouků a nízkému výnosu hedvábí z jednotlivých pavouků. Bylo zjištěno, že druh Nephila clavipes produkuje hedvábí, které je méně imunogenní než hedvábí bource morušového; má pevnost v tahu 4 x 109 N/m, což je šestkrát větší pevnost v tahu než ocel. Protože je pavoučí hedvábí proteolyticky degradováno, nedochází při degradaci k posunu pH oproti fyziologickému pH. Mezi další výhody pavoučího hedvábí patří jeho odolnost vůči plísňovému a bakteriálnímu rozkladu po dobu několika týdnů a skutečnost, že nenabobtná. Také struktura hedvábí podporuje přilnavost a migraci buněk. Sklizeň hedvábí je však stále únavný úkol a přesné složení se liší mezi jednotlivými druhy a dokonce i mezi jedinci stejného druhu v závislosti na stravě a prostředí. Objevily se pokusy o syntetickou výrobu pavoučího hedvábí. Jsou zapotřebí další studie, které by otestovaly proveditelnost použití nervového potrubí pavoučího hedvábí in vitro a in vivo.
Chitosan a chitin patří do skupiny biopolymerů složených z N-acetyl-D-glukosaminových a D-glukosaminových podjednotek vázaných na β(1-4). Chitosan vzniká alkalickou N-deacetylací chitinu, který je druhým nejrozšířenějším přírodním polymerem po celulóze. Chitosan je biologicky rozložitelný polysacharid, který byl užitečný v mnoha biomedicínských aplikacích, jako je chelatační činidlo, nosič léků, membrána a přísada do úpravy vody. Chitosan je rozpustný ve zředěných vodných roztocích, ale sráží se do gelu při neutrálním pH. Nepodporuje dobře vazbu a proliferaci nervových buněk, ale může být posílen vazbou peptidů odvozených od ECM. Chitosan také obsahuje slabé mechanické vlastnosti, které je náročnější překonat.
Stupeň acetylace (DA) pro rozpustný chitosan se pohybuje od 0% do 60% v závislosti na podmínkách zpracování. Byla provedena studie, která charakterizovala, jak různý DA ovlivňuje vlastnosti chitosanu. Různý DA byl získán za použití acetanhydridu nebo alkalické hydrolýzy. Bylo zjištěno, že klesající acetylace vedla ke zvýšení pevnosti v tlaku. Biologický rozklad byl zkoumán za použití lysozymu, o kterém je známo, že je zodpovědný hlavně za rozklad chitosanu in vivo hydrolýzou jeho glykosidických vazeb a je uvolněn fagocytárními buňkami po nervovém poškození. Výsledky ukazují, že došlo ke zrychlené ztrátě hmoty u meziproduktu DAs ve srovnání s vysokým a nízkým DAs během sledovaného časového období. Když byly DRG buňky vypěstovány na N-acetylovaném chitosanu, buněčná životaschopnost se snižovala se zvyšujícím se DA. Chitosan má také rostoucí hustotu náboje se snižujícím se DA, což je zodpovědné za větší adhezi buňky. Kontrola DA chitosanu je tedy důležitá pro regulaci doby rozkladu. Tyto znalosti by mohly pomoci při vývoji nervového vodicího vedení z chitosanu.
Nedávno bylo prokázáno, že aragonitová lešení podporují růst neuronů z potkaních hipokampů. Shany a kol. (2006) prokázali, že aragonitová matrice mohou podporovat růst astrocytárních sítí in vitro a in vivo. Aragonitová lešení tak mohou být užitečná pro opravu a regeneraci nervové tkáně. Existuje hypotéza, že aragonitová Ca2+ je nezbytná pro podporu buněčné přilnavosti a buněčného kontaktu. To se pravděpodobně provádí pomocí adhezních molekul závislých na Ca2+, jako jsou kadheriny. Aragonitová krystalická matrice má oproti hydrogelům mnoho výhod. Mají větší póry, což umožňuje lepší růst buněk, a materiál je bioaktivní v důsledku uvolnění Ca2+, což podporuje buněčnou přilnavost a přežití. Aragonitová matrice má navíc vyšší mechanickou pevnost než hydrogely, což jim umožňuje odolávat většímu tlaku při stlačení do poraněné tkáně.
Alginát je polysacharid, který snadno tvoří řetězce; může být na svých karboxylových skupinách křížen s multivalentními kationty, jako jsou Cu2+, Ca2+, nebo Al3+, a vytvořit tak mechanicky stabilnější hydrogel. Algináty vápenaté tvoří polymery, které jsou biokompatibilní i neimunogenní a byly použity v aplikacích tkáňového inženýrství. Nejsou však schopny podélně orientovaného růstu, což je nezbytné pro opětovné spojení proximálního konce s jeho cílem. Aby se tento problém překonal, byly vyvinuty anizotropní kapilární hydrogely (ACH). Vznikají překrytím vodných roztoků alginátu sodného vodnými roztoky multivalentních kationtů ve vrstvách. Po vytvoření se ionty elektrolytů difundují do vrstev polymerních roztoků a disopační konvektivní proces způsobí sražení iontů, čímž se vytvoří kapiláry. Disipativní konvektivní proces vede k odporu difuzních gradientů a tření mezi polyelektrolytovými řetězci. Kapilární stěny jsou lemovány vysráženým kovovým alginátem, zatímco lumen je naplněn extrudovanou vodou.
Prang a kol. (2006) hodnotili schopnost ACH gelů podporovat řízený axonální regrowth v poškozené savčí CNS. Multivalentní ionty použité k vytvoření ACH gelů na bázi alginátu byly ionty mědi, jejichž difúze do vrstvy alginátu sodného vytvořila hexagonálně strukturované anizotropní kapilární gely. Po vysrážení byl celý gel procházen podélně orientovanými kapilárami. ACH lešení podporovalo přežití dospělých NPC a vysoce orientovanou regeneraci axonů. Jedná se o první případ použití alginátů k výrobě anizotropních strukturovaných kapilárních gelů. Budoucí studie musí studovat dlouhodobou fyzickou stabilitu ACH lešení, protože regenerace axonů CNS může trvat mnoho měsíců; kromě schopnosti poskytovat dlouhodobou podporu však lešení musí být také rozložitelné. Ze všech biologických a syntetických biopolymerů zkoumaných Prangem a kol. (2006) byly pouze gely na bázi agarózy schopny srovnání s lineární regenerací způsobenou ACH lešeními. Budoucí studie budou muset také zkoumat, zda ACH lešení umožňují reinnervaci cíle in vivo po poranění míchy.
Kyselina hyaluronová (HA) je široce používaný biomateriál díky své vynikající biokompatibilitě a rozmanitosti fyziologických funkcí. Je hojná v extracelulární matrix (ECM), kde váže velké glykosaminoglykany (GAG) a proteoglykany prostřednictvím specifických interakcí HA-protein. HA také váže povrchové receptory buněk, jako je CD44, což má za následek aktivaci intracelulárních signalizačních kaskád, které regulují přilnavost a motilitu buněk a podporují proliferaci a diferenciaci. O HA je také známo, že podporuje angiogenezi, protože jeho produkty degradace stimulují proliferaci a migraci endoteliálních buněk. HA tak hraje stěžejní roli při udržování normálních procesů nezbytných pro přežití tkání. Neupravený HA byl použit v klinických aplikacích, jako je oční chirurgie, hojení ran a plastická chirurgie. HA může být spojen s tvorbou hydrogelů. HA hydrogely, které byly buď neupravené nebo modifikované lamininem, byly implantovány do léze centrálního nervového systému dospělého člověka a testovány na jejich schopnost indukovat tvorbu nervové tkáně ve studii Hou et al. Prokázaly schopnost podporovat zarůstání buněk a angiogenezi, kromě toho inhibovaly tvorbu jizev po glii. Také HA hydrogely modifikované lamininem byly schopny podpořit rozšíření neuritu. Tyto výsledky podporují HA gely jako slibný biomateriál pro vedení nervů.
Kromě materiálu pro lešení a fyzických podnětů mohou být biologické podněty také začleněny do bioumělého nervového potrubí ve formě buněk. V nervovém systému existuje mnoho různých typů buněk, které pomáhají podporovat růst a udržování neuronů. Tyto buňky jsou souhrnně označovány jako gliální buňky. Gliální buňky byly zkoumány ve snaze porozumět mechanismům, které stojí za jejich schopnostmi podporovat regeneraci axonů. Jsou diskutovány tři typy gliálních buněk: Schwannovy buňky, astrocyty a čichové zahnívající buňky. Kromě gliálních buněk mají kmenové buňky také potenciální přínos pro obnovu a regeneraci, protože mnohé z nich jsou schopny se diferencovat na neurony nebo gliální buňky. Tento článek se stručně zabývá použitím dospělých transdiferencovaných mezenchymálních, ektomechanálních, neurálních a neurálních progenitorových kmenových buněk.
Gliální buňky jsou nezbytné pro podporu růstu a udržování neuronů v periferním a centrálním nervovém systému. Většina gliových buněk je specifická buď pro periferní nebo centrální nervový systém. Schwannovy buňky se nacházejí v periferním nervovém systému, kde myelinizují axony neuronů. Astrocyty jsou specifické pro centrální nervový systém; poskytují neuronům živiny, fyzickou podporu a izolaci. Tvoří také hematoencefalickou bariéru. Čichové ensheatovací buňky však překračují hranici CNS-PNS, protože vedou neurony čichových receptorů z PNS do CNS.
Schwannovy buňky (SC) jsou klíčové pro regeneraci periferních nervů; hrají strukturální i funkční roli. Schwannovy buňky jsou zodpovědné za účast na Wallerianově degeneraci i na Bungnerových pásmech. Při poškození periferního nervu mění Schwannovy buňky svou morfologii, chování a proliferaci, aby se zapojily do Wallerianovy degenerace a Bungnerových pásem. Při Wallerianově degeneraci rostou Schwannovy buňky v uspořádaných sloupcích podél endoneurální trubice, čímž se vytváří Bungnerovo pásmo (boB), které chrání a uchovává endoneurální kanál. Navíc uvolňují neurotrofické faktory, které posilují opětovný růst ve spojení s makrofágy. Používání Schwannových buněk v inženýrství nervové tkáně má určité nevýhody; například je obtížné selektivně izolovat Schwannovy buňky a po izolování vykazují špatnou proliferaci. Jedním ze způsobů, jak tuto obtíž překonat, je uměle indukovat ostatní buňky, jako jsou kmenové buňky, do fenotypů podobných SC.
Eguchi a kol. (2003) zkoumali použití magnetických polí s cílem zarovnat Schwannovy buňky. Použili horizontální typ supravodivého magnetu, který v jeho středu vytváří 8 T pole. Během 60 hodin expozice se Schwannovy buňky zarovnaly rovnoběžně s polem; během stejného intervalu nebyly Schwannovy buňky vystaveny působení orientované náhodně. Existuje hypotéza, že rozdíly v citlivosti membránových složek a cytoskeletálních prvků na magnetické pole mohou způsobit magnetickou orientaci. Kolagenová vlákna byla také vystavena magnetickému poli a během 2 hodin se zarovnala kolmo k magnetickému poli, zatímco kolagenová vlákna tvořila náhodný síťový vzor bez vystavení magnetickému poli. Při kultivaci na kolagenových vláknech se Schwannovy buňky po dvou hodinách expozice 8-T magnetickému poli zarovnaly podél magneticky orientovaného kolagenu. Oproti tomu Schwannovy buňky se náhodně orientovaly na kolagenová vlákna bez vystavení magnetickému poli. Kultivace na kolagenových vláknech tak umožnila Schwannovým buňkám orientovat se kolmo na magnetické pole a orientovat se mnohem rychleji.
Tato zjištění mohou být užitečná pro zarovnání Schwannových buněk při poranění nervového systému, aby se podpořila tvorba Bungnerových pásem, které jsou klíčové pro udržení endoneurální trubice, která vede regulující se axony zpět k jejich cílům. Je téměř nemožné zarovnat Schwannovy buňky externími fyzikálními technikami; proto je objev alternativní techniky pro zarovnání významný. Nicméně vyvinutá technika má stále své nevýhody, a to, že vyžaduje značné množství energie k udržení magnetického pole po delší dobu.
Studie byly provedeny v pokusech o zvýšení migrační schopnosti Schwannových buněk. Migrace Schwannových buněk je regulována integriny s ECM molekulami, jako je fibronektin a laminin. Kromě toho je známo, že adhezní molekula nervových buněk (NCAM) zvyšuje motilitu Schwannových buněk in vitro. NCAM je glykoprotein, který je exprimován na axonálních a Schwannových buněčných membránách. Kyselina polysialová (PSA) je syntetizována na NCAM pomocí polysialyltransferázy (PST) a sialyltransferázy X (STX). Během vývoje CNS je exprese PSA na NCAM regulována až do postnatálních stadií. V dospělém mozku se však PSA vyskytuje pouze v oblastech s vysokou plasticitou.
. Na Schwannových buňkách nedochází k expresi PSA.
Lavdas et al. (2006) zkoumal, zda trvalá exprese PSA na Schwannových buňkách zvyšuje jejich migraci. Schwannovy buňky byly trandukovány retrovirovým vektorem kódujícím STX za účelem indukce exprese PSA. Schwannovy buňky exprimující PSA skutečně získaly zvýšenou motilitu, jak bylo prokázáno v testu přemostění mezer a po transplantaci v postnatálních kulturách předního mozku. Exprese PSA nezměnila molekulární a morfologickou diferenciaci. Schwannovy buňky exprimující PSA byly schopny myelinizovat axony CNS v mozečkových řezech, což není normálně možné in vivo. Je naděje, že tyto Schwannovy buňky exprimující PSA budou schopny migrovat v rámci CNS bez ztráty myelinizačních schopností a mohou se stát užitečnými pro regeneraci a myelinizaci axonů v centrálním nervovém systému.
Astrocyty jsou gliální buňky, které se hojně vyskytují v centrálním nervovém systému. Jsou klíčové pro metabolickou a trofickou podporu neuronů; navíc astrocyty poskytují iontový pufr a clearance neurotransmiterů. Rostoucí axony jsou řízeny podněty vytvořenými astrocyty; astrocyty tak mohou regulovat hledání nervových drah a následně vzorování ve vyvíjejícím se mozku. Jizva po gliu, která se tvoří po poranění v centrálním nervovém systému, je tvořena astrocyty a fibroblasty; je nejvýznamnější překážkou pro regeneraci. Jizva po gliu se skládá z hypertrofovaných astrocytů, pojivové tkáně a ECM. Dva cíle inženýrství nervové tkáně jsou pochopit funkci astrocytů a vyvinout kontrolu nad astrocytárním růstem. Studie Shanyho a kol. (2006) prokázaly, že míra přežití astrocytů je zvýšena na 3D aragonitových matricích ve srovnání s konvenčními 2D buněčnými kulturami. Schopnost buněčných procesů roztáhnout se napříč křivkami a póry umožňuje tvorbu více buněčných vrstev se složitými 3D konfiguracemi.
Tři odlišné způsoby, kterými buňky získal 3D tvar jsou:
V konvenční buněčné kultuře je růst omezen na jednu rovinu, což způsobuje tvorbu jedné vrstvy, kdy se většina buněk dotýká povrchu; nicméně 3D zakřivení povrchu aragonitu umožňuje vznik více vrstev a pro astrocyty daleko od sebe vzájemný kontakt. Je důležité podporovat tvorbu procesů podobnou 3D podmínkám in vivo, protože astrocytická morfologie procesů je nezbytná při usměrňování směru regeneračních axonů. Topografie aragonitů poskytuje vysoký poměr plochy k objemu a postrádá okraje, což vede ke snížení efektu okraje kultury. Krystalické matrice, jako je zde zmíněný aragonit, umožňují podporu složité 3D tkáňové formace, která se blíží podmínkám in vivo.
Čichové zahušťovací buňky
Primární čichový systém savců si zachoval schopnost nepřetržité regenerace během dospělosti. Čichové receptorové neurony mají průměrnou životnost 6-8 týdnů, a proto musí být nahrazeny buňkami odlišenými od kmenových buněk, které jsou ve vrstvě na bázi blízkého epitelu. Nové čichové receptorové neurony musí promítat své axony přes CNS do čichové bulby, aby byly funkční. Axonální růst je řízen gliálním složením a cytoarchitekturou čichové bulby kromě přítomnosti čichových zahušťovacích buněk (OEC).
Předpokládá se, že OEC pocházejí z čichového plakódu, což naznačuje jiný vývojový původ než jiné podobné mikroglie nervového systému.
Dalším zajímavým konceptem je, že OEC se vyskytují jak v periferní, tak centrální nervové soustavě primárního čichového systému, tedy čichového epitelu a žárovky.
OECs jsou podobné Schwannovým buňkám v tom, že poskytují upregulaci p75 receptoru NGF s nízkou afinitou po poranění; nicméně na rozdíl od Schwannových buněk produkují nižší hladiny neurotropinů. Několik studií prokázalo, že OECs jsou schopny podporovat regeneraci poškozených axonů, ale tyto výsledky často nelze reprodukovat.
Bez ohledu na to byly OECs důkladně zkoumány v souvislosti s poraněním míchy, amyotrofickou laterální sklerózou a dalšími neurodegenerativními onemocněními. Výzkumníci naznačují, že tyto buňky mají jedinečnou schopnost remyelinizovat poraněné neurony.
OEC mají vlastnosti podobné astrocytům, u obou bylo zjištěno, že jsou citlivé na virovou infekci.
Kmenové buňky se vyznačují schopností samoregenerace po delší dobu a stále si udržují schopnost diferenciace podle jedné nebo více buněčných linií. Kmenové buňky mohou být unipotentní, multipotentní nebo pluripotentní, což znamená, že se mohou diferencovat na jeden, více nebo všechny typy buněk. Pluripotentní kmenové buňky se mohou stát buňkami odvozenými z kterékoli ze tří vrstev zárodečných embryí. Kmenové buňky mají oproti gliovým buňkám výhodu, protože jsou schopny se snáze množit v kultuře. Zůstává však obtížné přednostně diferencovat tyto buňky na různé typy buněk uspořádaným způsobem. Další potíž kmenových buněk je nedostatek dobře definované definice kmenových buněk mimo hematopoetické kmenové buňky (HSC). Každý „typ“ kmenové buňky má více než jednu metodu identifikace, izolace a rozšíření buněk; to způsobilo velký zmatek, protože všechny kmenové buňky „typu“ (neurální, mezenchymální, retinální) se nemusí nutně chovat stejným způsobem za stejných podmínek.
Dospělé kmenové buňky nejsou schopny se in vitro proliferovat a diferencovat tak účinně, jak jsou schopny in vivo. Dospělé kmenové buňky mohou pocházet z mnoha různých tkáňových lokalit, ale je obtížné je izolovat, protože jsou definovány chováním a ne povrchovými markery. Dosud nebyla vyvinuta metoda pro jasné rozlišení mezi kmenovými buňkami a diferencovanými buňkami, které je obklopují. Nicméně povrchové markery mohou být stále do určité míry použity k odstranění většiny nežádoucích diferencovaných buněk. Plastičnost kmenových buněk je schopnost diferencovat se přes hranice embryonálních zárodečných linií. Ačkoli je přítomnost plasticity ostře zpochybňována. Někteří tvrdí, že plasticita je způsobena heterogenitou mezi buňkami nebo událostmi fúze buněk. V současnosti mohou být buňky diferencovány napříč buněčnými liniemi s výnosy v rozmezí od 10% do 90% v závislosti na použitých technikách. Je třeba provést více studií, aby se standardizoval výnos s transdiferenciací. Transdiferenciace multipotentních kmenových buněk je potenciálním prostředkem pro získání kmenových buněk, které nejsou dostupné nebo se nedají snadno získat u dospělého jedince.
Mezochymální kmenové buňky jsou dospělé kmenové buňky, které se nacházejí v kostní dřeni; jsou schopny se diferencovat do linií mezodermálního původu. Některé příklady tkání, které vytvářejí, jsou kosti, chrupavky, tuk a šlachy. MSCs se získávají odsáváním kostní dřeně. Růst MSCs podporuje mnoho faktorů včetně: růstový faktor odvozený od krevních destiček, epidermální růstový faktor β a inzulínu podobný růstový faktor-1. Kromě jejich normálních diferenciačních drah mohou být MSCs transdiferencovány podle jiných než mesenchymálních linií, jako jsou astrocyty, neurony a myelinizační buňky PNS. MSCs jsou potenciálně užitečné pro strategie regenerace nervů, protože:
Keilhoff a kol. (2006) provedli studii porovnávající schopnost nervové regenerace nediferencovaných a transdiferencovaných MSCs se Schwannovými buňkami v devitalizovaných svalových štěpech překlenujících dvoucentimetrovou mezeru v sedacím nervu potkanů. Všechny buňky byly autologní. Transdiferencované MSCs byly kultivovány ve směsi faktorů s cílem podpořit tvorbu Schwannových buněk. Nediferencované MSCs nevykazovaly žádnou schopnost regenerace, zatímco transdiferencované MSCs vykazovaly určitou schopnost regenerace, i když nedosáhly kapacity Schwannových buněk.
Ekomesenchymální kmenové buňky (EMSC)
Neurální kmenové buňky (NSC) mají schopnost sebeobnovy a diferenciace na neuronální a gliální linie. Pro řízení diferenciace NSC bylo vyvinuto mnoho kultivačních metod; nicméně tvorba biomateriálů pro řízení diferenciace NSC je považována za klinicky relevantnější a použitelnější technologii.[nutná citace] Jedním z přístupů k vývoji biomateriálu pro řízení diferenciace NSC je kombinovat extracelulární matrixové složky (ECM) a růstové faktory. Velmi nedávná studie Nakajimy, Ishimura a kol. zkoumala účinky různých molekulárních párů sestávajících z růstového faktoru a ECM složky na diferenciaci NSC na astrocyty a neuronální buňky. Zkoumané ECM složky byly laminin-1 a fibronektin, což jsou přirozené ECM složky, a ProNectin F plus (Pro-F) a ProNectin L (Pro-L), což jsou umělé ECM složky, a poly(ethyleneimin) (PEI). Použitými neurotrofickými faktory byly epidermální růstový faktor (EGF), fibroblastový růstový faktor-2 (FGF-2), nervový růstový faktor (NGF), neurotrophin-3 (NT-3) a ciliární neurotrofický faktor (CNTF). Kombinace dvojic byly imobilizovány na maticová buněčná pole, na kterých byly kultivovány NSC. Po 2 dnech kultivace byly buňky obarveny protilátkami proti nestinu, β-tubulinu III a GFAP, což jsou markery NSC, neuronálních buněk a astrocytů. Výsledky poskytují cenné informace o výhodných kombinacích složek ECM a růstových faktorů jako praktické metody pro vývoj biomateriálu pro směrování diferenciace NSC.
V současné době jsou neurotrofické faktory intenzivně studovány pro použití v bioumělých nervových spojích, protože jsou nezbytné in vivo pro usměrňování růstu a regenerace axonů. Ve studiích se neurotrofické faktory běžně používají ve spojení s jinými technikami, jako jsou biologické a fyzikální podněty vytvořené přidáním buněk a specifických topografií. Neurotrofické faktory mohou, ale nemusí být imobilizovány na konstrukci lešení, i když imobilizace je preferována, protože umožňuje vytvoření trvalých, kontrolovatelných přechodů. V některých případech, jako jsou nervové systémy pro podávání léků, jsou volně imobilizovány tak, že mohou být selektivně uvolněny ve stanovených časech a ve stanoveném množství. Podání léků je dalším krokem mimo základní přidání růstových faktorů do nervových vodicích spojů.
Mnoho biomateriálů používaných pro vedení nervových spojů jsou biomimetické materiály. Biomimetické materiály jsou materiály, které byly navrženy tak, aby vyvolávaly specifické buněčné reakce zprostředkované interakcemi s peptidy vázanými na lešení z proteinů ECM; v podstatě jde o začlenění peptidů vázajících buňky do biomateriálů prostřednictvím chemické nebo fyzikální modifikace.
Synergismus se často vyskytuje při kombinaci dvou prvků; jedná se o interakci mezi dvěma prvky, která způsobuje efekt větší než kombinované účinky každého prvku zvlášť. Synergismus je patrný při kombinaci materiálu lešení a topografie s buněčnými terapiemi, neurotrofickými faktory a biomimetickými materiály. Zkoumání synergismu je dalším krokem poté, co se jednotlivé techniky samy o sobě osvědčily. Kombinace těchto různých faktorů je třeba pečlivě studovat, aby se synergické účinky optimalizovaly.
Optimalizace kombinací neurotrofických faktorů
Byla vyslovena hypotéza, že interakce mezi neurotrofickými faktory mohou měnit optimální koncentrace každého faktoru. Zatímco buněčné přežití a udržování fenotypu jsou důležité, důraz při hodnocení byl kladen na prodloužení neuritu. Kombinace NGF, neurotrofického faktoru odvozeného od gliových buněk (GDNF) a ciliárního neurotrofického faktoru (CNTF) byla prezentována kultuře gangliových kořenů in vitro. Byl použit jeden faktor z každé neurotrofické rodiny. Bylo zjištěno, že neexistuje rozdíl v individuální optimální koncentraci a kombinatorické optimální koncentraci; nicméně kolem 5. nebo 6. dne neurity přestaly prodlužovat a začaly degradovat. Byla vyslovena hypotéza, že je to způsobeno nedostatkem kritické živiny nebo správných gradientů; předchozí studie ukázaly, že růstové faktory jsou schopny optimalizovat prodloužení neuritu nejlépe, pokud jsou prezentovány v gradientech. Budoucí studie kombinací neurotrofických faktorů budou muset zahrnovat gradienty.
Kombinace adhezních molekul nervových buněk a GFD-5
Buněčné adhezní molekuly (CAM) a neurotrofické faktory vložené společně do biologicky kompatibilních matric jsou relativně novým konceptem, který se zkoumá. CAM z imunoglobulinové superrodiny (IgSF), která zahrnuje L1/NgCAM a neurofascin, jsou obzvláště slibné, protože jsou exprimovány ve vyvíjejícím se nervovém systému na neuronech nebo Schwannových buňkách. Je o nich známo, že slouží jako naváděcí podněty a zprostředkovávají diferenciaci neuronů. Neurotrofické faktory jako NGF a růstový diferenciační faktor 5 (GDF-5) jsou však dobře zavedené jako propagátory regenerace in vivo. Nedávná studie Niere, Browna a kol. zkoumala synergické účinky kombinace L1 a neurofascinu s NGF a GDF-5 na DRG neurony v kultuře; tato kombinace zvýšila výrůstek neuritu. Další zlepšení bylo prokázáno spojením L1 a neurofascinu do umělého fúzního proteinu, což zvyšuje účinnost, protože faktory nejsou dodávány jednotlivě. Nejenže mohou být použity různé podněty, ale mohou být dokonce sloučeny do jednoho „nového“ podnětu.
Topografie v součinnosti s chemickými a biologickými podněty
Vliv prezentace více typů podnětů, jako jsou chemické, fyzikální a biologické podněty, na diferenciaci neuronových progenitorových buněk nebyl zkoumán. Byla provedena studie, ve které byly prezentovány tři různé podněty dospělým potkaním hipokampálním progenitorovým buňkám (AHPC): postnatální potkaní astrocyty typu 1 (biologické), laminin (chemické) a mikrovzorovaný substrát (fyzikální). Více než 75% AHPC se zarovnalo do 20° rýh ve srovnání s náhodným růstem na nesevzorovaných substrátech. Když se AHPC pěstovaly na mikrovzorovaných substrátech s astrocyty, byl výrůstek ovlivněn astrocyty, které se zarovnaly s rýhami; konkrétně AHPC rozšířily procesy podél astrocytických cytoskeletálních vláken. Nicméně zarovnání nebylo tak významné, jako to, které AHPC pozorovaly v kultuře samotné s mikrovzorovaným substrátem. Aby bylo možné posoudit různé fenotypy vyjádřené jako výsledek diferenciace, byly buňky obarveny protilátkami na β-tubulin třídy III (TuJI), receptor interagující protein (RIP) a gliální fibrilární kyselý protein (GFAP), které jsou markery pro rané neurony, oligodendrocyty, respektive astrocyty. Největší množství diferenciace bylo pozorováno u AHPC kultivovaných na vzorovaných substrátech s astrocyty.