Sedm-transmembránová α-helixová struktura receptoru spřaženého s G-proteinem
Receptory spřažené s G proteinem (GPCR), známé také jako receptory sedmi transmembránových domén, 7TM receptory, heptahelické receptory, serpentinové receptory a receptory spřažené s G proteinem (GPLR), tvoří velkou proteinovou rodinu receptorů, které vnímají molekuly vně buňky a aktivují vnitřní signální transdukční dráhy a nakonec i buněčné reakce. Nazývají se transmembránové receptory, protože procházejí buněčnou membránou, a nazývají se sedmi transmembránové receptory, protože procházejí buněčnou membránou sedmkrát.
Receptory spřažené s G proteinem se nacházejí pouze u eukaryot, včetně kvasinek, choanoflagelátů a zvířat. Mezi ligandy, které tyto receptory vážou a aktivují, patří sloučeniny citlivé na světlo, pachy, feromony, hormony a neurotransmitery a liší se velikostí od malých molekul přes peptidy až po velké proteiny. Receptory spřažené s G proteinem se podílejí na mnoha onemocněních a jsou také cílem přibližně 40% všech moderních léčivých léků. Nobelova cena za chemii za rok 2012 byla udělena Brianu Kobilkovi a Robertu Lefkowitzovi za jejich práci, která byla „zásadní pro pochopení toho, jak fungují receptory spřažené s G proteinem“.
Existují dvě hlavní signální transdukční dráhy zahrnující receptory spřažené s G proteinem: signální dráha cAMP a signální dráha fosfatidylinositolu. Když se ligand naváže na GPCR, způsobí konformační změnu v GPCR, což mu umožní působit jako guaninový nukleotidový výměnný faktor (GEF). GPCR pak může aktivovat asociovaný G-protein výměnou jeho vázaného HDP za GTP. α podjednotka G-proteinu spolu s vázaným GTP se pak mohou oddělit od β a γ podjednotek a dále ovlivňovat intracelulární signalizační proteiny nebo cílové funkční proteiny přímo v závislosti na typu α podjednotky (Gαs, Gαi/o, Gαq/11, Gα12/13).:1160
Klasifikační schéma GPCR. Třída A (podobná rhodopsinu), třída B (podobná sekretinu), třída C (podobná glutamátovému receptoru), ostatní (adheze (33), frizzled (11), Taste type-2 (25), nezařazená (23)).
Přesná velikost superrodiny GPCR není známa, ale na základě analýzy sekvence genomu bylo předpovězeno téměř 800 různých lidských genů (nebo ≈4% celého genomu kódujícího proteiny). Ačkoli bylo navrženo mnoho klasifikačních schémat, superrodina je klasicky rozdělena do tří hlavních tříd (A, B a C) bez zjistitelné sdílené sekvenční homologie mezi třídami. Zdaleka největší třídou je třída A, která tvoří téměř 85% genů GPCR. U GPCR třídy A se předpokládá, že více než polovina z nich kóduje čichové receptory, zatímco zbývající receptory jsou vázány známými endogenními sloučeninami nebo jsou klasifikovány jako vzácné receptory. I přes absenci sekvenční homologie mezi třídami mají všechny GPCR společnou strukturu a mechanismus přenosu signálu.
Ve všech lze GPCR seskupit do 6 tříd na základě sekvenční homologie a funkční podobnosti:
Velmi velká skupina s rhodopsinem A byla dále rozdělena do 19 podskupin (A1-A19). V poslední době byl navržen alternativní klasifikační systém s názvem GRAFS (Glutamát, Rhodopsin, Adhesion, Frizzled/Taste2, Secretin).
Lidský genom kóduje tisíce receptorů spřažených s G proteinem, z nichž asi 350 detekuje hormony, růstové faktory a další endogenní ligandy. Přibližně 150 GPCR nalezených v lidském genomu má neznámé funkce.
Některé webové servery a metody predikce bioinformatiky byly použity pro predikci klasifikace GPCR pouze podle sekvence aminokyselin pomocí přístupu pseudo aminokyselinového složení.
GPCR jsou integrální membránové proteiny, které mají sedm membránových domén nebo transmembránových šroubovic. Extracelulární části receptoru mohou být glykosylovány. Tyto extracelulární smyčky také obsahují dvě vysoce konzervovaná cysteinová rezidua, která tvoří disulfidové vazby ke stabilizaci receptorové struktury. Některé proteiny sedmi transmembránových šroubovic (channelrhodopsin), které se podobají GPCR, mohou v rámci svého proteinu obsahovat iontové kanály.
Podobně jako GPCR mají adiponektinové receptory 1 a 2 (ADIPOR1 a ADIPOR2) také 7 transmembránových domén. ADIPOR1 a ADIPOR2 jsou však orientovány opačně než GPCR v membráně (tj. cytoplazmatický N-konec, extracelulární C-konec) a nespojují se s G proteiny.
Rovněž byly stanoveny struktury aktivovaných a/nebo agonisty vázaných GPCR. Tyto struktury naznačují, jak vazba ligandu na extracelulární straně receptoru vede ke konformačním změnám na cytoplazmatické straně receptoru. Největší změnou je vnější pohyb cytoplazmatické části 5. a 6. transmembránové šroubovice (TM5 a TM6). Struktura aktivovaného beta-2 adrenergního receptoru v komplexu s G potvrdila, že Gα se váže na dutinu vytvořenou tímto pohybem.
Vztahy mezi strukturou a funkcí
Dvoudimenzionální schéma generického GPCR zasazeného do Lipidového voru. Kliknutím na obrázek pro vyšší rozlišení zobrazíte podrobnosti týkající se umístění důležitých staveb.
Strukturálně jsou GPCR charakterizovány extracelulárním N-vyústěním, následovaným sedmi transmembránovými (7-TM) α-helicii (TM-1 až TM-7) spojenými třemi intracelulárními (IL-1 až IL-3) a třemi extracelulárními smyčkami (EL-1 až EL-3) a nakonec intracelulárním C-vyústěním. GPCR se uspořádá do terciální struktury připomínající sud, se sedmi transmembránovými helicii tvořícími dutinu uvnitř plazmatické membrány, která slouží doméně vázající ligandy, která je často pokryta EL-2. Ligandy se však mohou vázat i jinde, jak je tomu v případě objemnějších ligandů (např. proteinů nebo velkých peptidů), které místo toho interagují s extracelulárními smyčkami, nebo, jak ilustruje třída C metabotropních glutamátových receptorů (mGluR), N-koncový ocas. Třída C GPCR se odlišuje svým velkým N-koncovým ocasem, který také obsahuje doménu vázající ligandy. Po navázání glutamátu na mGluR prochází N-koncový ocas konformační změnou, která vede k jeho interakci se zbytky extracelulárních smyček a TM domén. Konečným účinkem všech tří typů agonisty indukované aktivace je změna relativní orientace TM šroubovic (připodobněná k kroutivému pohybu) vedoucí k širšímu intracelulárnímu povrchu a „odhalení“ zbytků intracelulárních šroubovic a TM domén rozhodujících pro funkci transdukce signálu (tj. spřažení G-proteinu). Inverzní agonisté a antagonisté se mohou také vázat na řadu různých míst, ale konečným účinkem musí být prevence této reorientace TM šroubovice.
Struktura N- a C-koncových koncovek GPCR může také sloužit důležitým funkcím nad rámec vazby ligandu. Zejména C-terminus často obsahuje zbytky serinu (Ser) nebo threoninu (Thr), které při fosforylaci zvyšují afinitu intracelulárního povrchu pro vazbu lešenářských proteinů nazývaných β-arrestiny (β-arr). Po navázání β-arrestiny jednak stericky zabraňují spojení G-proteinů a jednak mohou naverbovat další proteiny vedoucí k tvorbě signalizačních komplexů podílejících se na aktivaci mimobuněčných signálů regulovaných kináz (ERK) nebo na endocytóze receptorů (internalizaci). Vzhledem k tomu, že fosforylace těchto zbytků Ser a Thr se často vyskytuje v důsledku aktivace GPCR, je β-arr-zprostředkované oddělení G-proteinů a internalizace GPCR důležitým mechanismem desenzibilizace.
Posledním společným strukturním tématem mezi GPCR je palmitoylace jednoho nebo více míst C-koncového ohonu nebo intracelulárních smyček. Palmitoylace je kovalentní modifikace cysteinových (Cys) reziduí prostřednictvím přídavku hydrofobních acylových skupin a má za následek zacílení receptoru na mikrodomény bohaté na cholesterol a sfingolipid plazmatické membrány zvané lipidové rafty. Vzhledem k tomu, že mnohé z následných transduktorů a efektorových molekul GPCR (včetně těch, které se podílejí na negativních dráhách zpětné vazby) jsou také zacíleny na lipidové rafty, má to za následek usnadnění rychlé receptorové signalizace.
GPCR reagují na extracelulární signály zprostředkované obrovskou rozmanitostí agonistů, od proteinů přes biogenní aminy až po protony, ale všechny přenášejí tento signál mechanismem propojení G-proteinů. To je umožněno díky doméně guaninnukleotidového výměnného faktoru (GEF), primárně tvořené kombinací IL-2 a IL-3 spolu se sousedními zbytky přidružených TM helicí.
Karikatura znázorňující základní koncept GPCR Conformational Activation. Vazba ligandu narušuje iontovou vazbu mezi motivem E/DRY TM-3 a kyselými zbytky TM-6. V důsledku toho se GPCR reorganizuje, aby umožnila aktivaci G-alfa proteinů. Boční perspektiva je pohled shora a ze strany na GPCR, jak je zasazen do plazmatické membrány (membránové lipidy byly pro přehlednost vynechány). Intracelulární perspektiva ukazuje pohled, který se dívá na plazmatickou membránu zevnitř buňky.
Receptor spřažený s G proteinem je aktivován vnějším signálem ve formě ligandu nebo jiného mediátoru signálu. Tím se vytváří konformační změna v receptoru, což způsobuje aktivaci G proteinu. Další účinek závisí na typu G proteinu.
GPCR zahrnují receptory pro mediátory smyslových signálů (např. lehké a čichové stimulační molekuly), adenosin, bombesin, bradykinin, endotelin, kyselinu γ-aminomáselnou (GABA), růstový faktor hepatocytů (HGF), melanocortiny, neuropeptid Y, opioidní peptidy, opsiny, somatostatin, GH, tachykininy, členové vazoaktivní rodiny střevních peptidů a vazopresin; biogenní aminy (např. dopamin, epinefrin, norepinefrin, histamin, glutamát (metabotropní účinek), glukagon, acetylcholin (muskarinový účinek) a serotonin); chemokiny; lipidové mediátory zánětu (např. prostaglandiny, prostanoidy, faktor aktivující krevní destičky a leukotrieny); a peptidové hormony (např. kalcitonin, C5a anafylatoxin, folikuly stimulující hormon (FSH), hormon uvolňující gonadotropin (GnRH), neurokinin, thyrotropin uvolňující hormon (TRH), kanabinoidy a oxytocin). GPCR, které působí jako receptory pro stimuly, které ještě nebyly identifikovány, jsou známé jako receptory pro vzácná onemocnění.
Zatímco u jiných typů studovaných receptorů, kde se ligandy navážou externě na membránu, ligandy GPCR se obvykle navážou uvnitř transmembránové domény. Nicméně proteázou aktivované receptory jsou aktivovány štěpením části jejich extracelulární domény.
Krystalová struktura aktivovaného beta-2 adrenergního receptoru v komplexu s Gs(PDB položka 3SN6). Receptor je zbarven červeně, Gα zeleně, Gβ azurově a Gγ žlutě. C-konec Gα se nachází v dutině vytvořené vnějším pohybem cytoplazmatických částí TM5 a 6.
Transdukce signálu přes membránu receptorem není zcela pochopena. Je známo, že neaktivní G protein je vázán na receptor v jeho neaktivním stavu. Jakmile je ligand rozpoznán, receptor posune konformaci a tím mechanicky aktivuje G protein, který se od receptoru odpojí. Receptor nyní může buď aktivovat jiný G protein, nebo se vrátit zpět do svého neaktivního stavu. To je příliš zjednodušené vysvětlení, ale postačuje k vyjádření celkového souboru událostí.
Předpokládá se, že molekula receptoru existuje v konformační rovnováze mezi aktivními a neaktivními biofyzikálními stavy. Vazba ligandů na receptor může posunout rovnováhu směrem k aktivním receptorovým stavům. Existují tři typy ligandů: agonisté jsou ligandy, které posouvají rovnováhu ve prospěch aktivních stavů; inverzní agonisté jsou ligandy, které posouvají rovnováhu ve prospěch neaktivních stavů; a neutrální antagonisté jsou ligandy, které neovlivňují rovnováhu. Zatím není známo, jak přesně se aktivní a neaktivní stavy od sebe liší.
Cyklus aktivace/deaktivace G-proteinu
Karikatura zobrazující heterotrimerovský cyklus aktivace/deaktivace G-proteinu v kontextu signalizace GPCR
Když je receptor neaktivní, GEF doména se může vázat na také neaktivní α-podjednotku heterotrimerického G-proteinu. Tyto „G-proteiny“ jsou trimerem α, β a γ podjednotek (známých jako Gα, Gβ a Gγ), který se stane neaktivním, když se reverzibilně naváže na Guanosin difosfát (GDP) (nebo alternativně žádný guaninový nukleotid), ale aktivním, když se naváže na Guanosin trifosfát (GTP). Po aktivaci receptoru GEF doména zase alostericky aktivuje G-protein tím, že usnadňuje výměnu molekuly GDP za GTP v α-podjednotce G-proteinu. Buňka udržuje poměr cytosolové GTP:GDP 10:1, takže výměna za GTP je zajištěna. V tomto bodě se podjednotky G-proteinu disociují z receptoru, stejně jako navzájem, za vzniku Gα-GTP monomeru a úzce interagujícího Gβγ dimeru, které nyní mohou volně modulovat aktivitu jiných intracelulárních proteinů. Rozsah, v jakém se mohou difundovat, je však omezený kvůli palmitoylaci Gα a přítomnosti molekuly Glycosylphosphatidylinositolu (GPI), která byla kovalentně přidána do C-terminu Gγ. Fosfatidylinositolová část GPI-vazby obsahuje dvě hydrofobní acylové skupiny, které ukotvují jakékoliv GPI-vázané proteiny (např. Gβγ) k plazmatické membráně a také, do určité míry, k lokálnímu lipidovému raftu. (Srovnejte to s účinkem palmitoylace na lokalizaci GPCR, jak je popsáno výše)
Protože Gα má také schopnost pomalé GTP→GDP hydrolýzy, neaktivní forma α-podjednotky (Gα-GDP) se nakonec regeneruje, a tak umožňuje reassociaci s Gβγ dimerem za vzniku „klidového“ G-proteinu, který se může opět vázat na GPCR a čekat na aktivaci. Rychlost GTP hydrolýzy je často urychlena působením jiné rodiny alosterických modulujících proteinů nazývaných Regulátory G-proteinu Signaling, nebo RGS proteiny, které jsou typem GTPázu aktivujícího proteinu, nebo GAP. Ve skutečnosti má mnoho primárních efektorových proteinů (např. adenylátcyklázy), které se aktivují/inaktivují po interakci s Gα-GTP, také aktivitu GAP. Tudíž i v této rané fázi procesu má GPCR iniciovaná signalizace schopnost samoterminace.
Mechanismus receptorů spřažených s G-proteinem
Pokud receptor v aktivním stavu narazí na G protein, může ho aktivovat. Některé důkazy naznačují, že receptory a G proteiny jsou ve skutečnosti spřaženy. Například vazba G proteinů na receptory ovlivňuje afinitu receptoru k ligandům. Aktivované G proteiny jsou vázány na GTP.
Další transdukce signálu závisí na typu G proteinu. Příkladem buněčné bílkoviny, kterou lze regulovat G proteinem, v tomto případě G proteinem, je enzym adenylátcykláza. Aktivita adenylátcyklázy se aktivuje, když se naváže na podjednotku aktivovaného G proteinu. Aktivace adenylátcyklázy končí, když se G protein vrátí do stavu vázaného na HDP.
Adenylátcyklázy (z nichž je u lidí známo 9 membránových a jedna cytosolová forma) mohou být aktivovány nebo inhibovány i jinými způsoby (např. vazbou Ca2+/Calmodulin), které mohou aditivním nebo synergickým způsobem modifikovat aktivitu těchto enzymů spolu s G proteiny.
Signalizační dráhy aktivované prostřednictvím GPCR jsou omezeny primární sekvencí a terciární strukturou samotného GPCR, ale v konečném důsledku jsou určeny konkrétní konformací stabilizovanou konkrétním ligandem a také dostupností molekul převodníků. V současné době se má za to, že GPCR využívají dva primární typy převodníků: G-proteiny a β-arrestiny. Protože β-arry mají pouze vysokou afinitu k fosforylované formě většiny GPCR (viz výše nebo níže), je většina signalizace v konečném důsledku závislá na aktivaci G-proteinu. Nicméně možnost interakce umožňuje, aby došlo k signalizaci nezávislé na G-proteinu.
Signalizace závislá na G-proteinu
Existují tři hlavní signalizační dráhy zprostředkované G-proteinem, zprostředkované čtyřmi podtřídami G-proteinů, které se od sebe odlišují sekvenční homologií (Gαs, Gαi/o, Gαq/11 a Gα12/13). Každá podtřída G-proteinu se skládá z více proteinů, z nichž každý je produktem více genů a/nebo sestřihových variací, které jim mohou propůjčit rozdíly od subtilních po odlišné s ohledem na signalizační vlastnosti, ale obecně se zdají být rozumně seskupeny do čtyř tříd. Protože se nezdá, že by se vlastnosti přenosu signálu různých možných kombinací βγ od sebe radikálně lišily, jsou tyto třídy definovány podle izoformy jejich α-podjednotky.:1163
Většina GPCR je sice schopna aktivovat více než jeden podtyp Gα, ale zároveň dává přednost jednomu podtypu před druhým. Pokud aktivovaný podtyp závisí na ligandu, který je vázán na GPCR, nazývá se to funkční selektivita (také známá jako agonistou řízené obchodování, nebo konformační specifický agonismus). Vazba kteréhokoli jednotlivého agonisty však může také iniciovat aktivaci více různých G-proteinů, protože může být schopna stabilizovat více než jednu konformaci GEF domény GPCR, a to i v průběhu jedné interakce. Navíc konformace, která nejlépe aktivuje jednu izoformu Gα, může aktivovat jinou, pokud je preferovaná méně dostupná. Kromě toho mohou dráhy zpětné vazby vést k modifikacím receptorů (např. fosforylaci), které mění preferenci G-proteinu. Bez ohledu na tyto různé nuance je preferovaný partnerský pár GPCR obvykle definován podle G-proteinu, který je za většiny fyziologických a/nebo experimentálních podmínek nejnápadněji aktivován endogenním ligandem.
Výše uvedené popisy ignorují účinky Gβγ-signalizace, které mohou být také důležité, zejména v případě aktivovaných Gαi/o-spřažených GPCR. Primárními efektory Gβγ jsou různé iontové kanály, jako jsou G-proteinově regulované Inwardly Rectifying K+ kanály (GIRKs), napěťově řízené Ca2+ kanály typu P/Q a N, stejně jako některé izoformy AC a PLC, spolu s některými izoformami Phosphoinositide-3-Kinázy (PI3K).
Signalizace nezávislá na G-Proteinu
Ačkoli se má za to, že fungují pouze společně, GPCR mohou signalizovat prostřednictvím mechanismů nezávislých na G-proteinu a heterotrimerické G-proteiny mohou hrát funkční role nezávislé na GPCR. GPCR mohou signalizovat nezávisle prostřednictvím mnoha již zmíněných proteinů pro jejich role v signalizaci závislé na G-proteinu, jako jsou β-arrs, GRK a Srcs. Navíc další lešenářské proteiny podílející se na subcelulární lokalizaci GPCR (např. proteiny obsahující PDZ-doménu) mohou také působit jako převodníky signálu. Nejčastěji je efektor členem rodiny MAPK.
Koncem 90. let se začaly hromadit důkazy, které naznačují, že některé GPCR jsou schopny signalizovat bez G proteinů. Ukázalo se, že mitogenem aktivovaná proteinkináza ERK2, klíčový mediátor signálních transdukcí po aktivaci receptorů v mnoha drahách, je aktivována v reakci na aktivaci receptorů zprostředkovanou cAMP ve slizovité plísni D. discoideum navzdory absenci přidružených G protein α- a β-podjednotek.
V savčích buňkách bylo prokázáno, že tolik studovaný β2-adrenoreceptor aktivuje ERK2 dráhu po odpojení signálu zprostředkovaném G-proteinem. Proto se zdá pravděpodobné, že některé mechanismy dříve považované za čistě související se desenzibilizací receptorů jsou ve skutečnosti příklady toho, že receptory přepínají svou signální dráhu, místo aby byly jednoduše vypnuty.
Bylo prokázáno, že v ledvinových buňkách bradykininový receptor B2 přímo interaguje s proteinem tyrosinfosfatázou. Pro zprostředkování této interakce a následně antiproliferativního účinku bradykininu je nezbytná přítomnost tyrosinfosforylované sekvence ITIM (immunoreceptor tyrosin-based inhibiční motiv) v B2 receptoru.
Signalizace nezávislá na GPCR pomocí heterotrimerických G-proteinů
Ačkoli se jedná o relativně nezralou oblast výzkumu, zdá se, že heterotrimerické G-proteiny se mohou podílet i na signalizaci mimo GPCR. Existují důkazy o rolích signálních transduktorů v téměř všech ostatních typech signalizace zprostředkované receptory, včetně integrinů, receptorových tyrosinkináz (RTKs), cytokinových receptorů (JAK/STAT), jakož i modulace různých dalších „přídatných“ proteinů, jako jsou GEF, inhibitory disociace guanin-nukleotidů (GDI) a proteinové fosfatázy. Mohou se dokonce objevit specifické proteiny těchto tříd, jejichž primární funkcí je jako součást drah nezávislých na GPCR, označované jako Aktivátory signalizace G-proteinu (AGS). Jak všudypřítomnost těchto interakcí, tak význam podjednotek Gα vs. Gβγ pro tyto procesy jsou stále nejasné.
Podrobnosti o cAMP a PIP2 drahách
Aktivační účinky cAMP na protein Kinázu A
Vliv Rs a Gs v signálové dráze cAMP
Účinek Ri a Gi v signálové dráze cAMP
Existují dvě hlavní signální transdukční dráhy zahrnující receptory vázané na G protein: signální dráha cAMP a signální dráha fosfatidylinositolu.
Signální transdukce cAMP obsahuje 5 hlavních znaků: stimulační hormonální receptor (Rs) nebo inhibiční hormonální receptor (Ri)；Stimulativní regulační G-protein (Gs) nebo inhibiční regulační G-protein (Gi)；Adenylyl cykláza; Protein Kináza A (PKA); a cAMP fosfodiesteráza.
Stimulační hormonální receptor (Rs) je receptor, který se může vázat s molekulami stimulujícího signálu, zatímco inhibiční hormon (Ri) je receptor, který se může vázat s molekulami inhibičního signálu.
Stimulativní regulační G-protein je G protein vázaný na receptor stimulačního hormonu (Rs) a jeho α podjednotka po aktivaci by mohla stimulovat aktivitu enzymu nebo jiný intracelulární metabolismus. Naopak inhibiční regulační G-protein je vázán na receptor inhibičního hormonu a jeho α podjednotka po aktivaci by mohla inhibovat aktivitu enzymu nebo jiný intracelulární metabolismus.
Adenylyl cykláza je 12-transmembránový glukoprotein, který katalyzuje ATP za vzniku cAMP s pomocí kofaktoru Mg2+ nebo Mn2+. Vytvořený cAMP je druhým poslem v buněčném metabolismu a je alosterickým aktivátorem proteinkinázy A.
Protein kináza A je důležitý enzym v buněčném metabolismu díky své schopnosti regulovat buněčný metabolismus fosforylací specifických vázaných enzymů v metabolické dráze. Může také regulovat specifickou genovou expresi, buněčnou sekreci a propustnost membrán. Proteinový enzym obsahuje dvě katalytické podjednotky a dvě regulační podjednotky. Když neexistuje cAMP，komplex je neaktivní. Když se cAMP naváže na regulační podjednotky, změní se jejich konformace, což způsobí disociaci regulačních podjednotek, která aktivuje protein kinázu A a umožní další biologické účinky.
cAMP fosfodiesteráza je enzym, který může degradovat cAMP na 5′-AMP, který ukončí signál.
Cesta signálu fosfatidylinositolu
V signální dráze fosfatidylinositolu se molekula extracelulárního signálu váže s G-proteinovým receptorem (Gq) na buněčném povrchu a aktivuje fosfolipázu C, která je umístěna na plazmatické membráně. Lipáza hydrolyzuje fosfatidylinositol 4,5-bisfosfát (PIP2) na dva sekundové posly: Inositol 1,4,5-trisfosfát (IP3) a Diacylglycerol (DAG). IP3 se váže s receptorem v membráně hladkého endoplazmatického retikula a mitochondrií, pomáhá otevřít Ca2+ kanál. DAG pomáhá aktivovat Protein Kinázu C (PKC), která fosforyluje mnoho dalších proteinů, mění jejich katalytické aktivity, což vede k buněčným reakcím. Pozoruhodné jsou také účinky Ca2+: spolupracuje s DAG při aktivaci PKC a dokáže aktivovat CaM kinázovou dráhu, ve které vápníkem modulovaný protein kalmodulin (CaM) váže Ca2+, prochází změnou konformace a aktivuje CaM kinázu II, která má jedinečnou schopnost zvýšit svou vazebnou afinitu k CaM autofosforylací, což způsobuje, že CaM není k dispozici pro aktivaci jiných enzymů. Kináza pak fosforyluje cílové enzymy, reguluje jejich činnost. Obě signální dráhy jsou spojeny Ca2+-CaM, což je také regulační podjednotka adenylycyklázy a fosfodiesterázy v cAMP signální dráze.
GPCR se znecitliví, když jsou vystaveny svému ligandu po delší dobu. Existují dvě uznávané formy desenzibilizace: 1) homologní desenzibilizace, při které je aktivovaná GPCR sníženě regulována; a 2) heterologní desenzibilizace, při které aktivovaná GPCR způsobuje sníženou regulaci jiné GPCR. Klíčovou reakcí této downregulace je fosforylace intracelulární (nebo cytoplazmatické) receptorové domény proteinovými kinázami.
Fosforylace proteinkinázami závislými na cAMP
Cyklické AMP-dependentní proteinové kinázy (protein kináza A) jsou aktivovány signálním řetězcem přicházejícím z G proteinu (který byl aktivován receptorem) přes adenylátcyklázu a cyklický AMP (cAMP). V mechanismu zpětné vazby tyto aktivované kinázy fosforylují receptor. Čím déle receptor zůstává aktivní, tím více kináz je aktivováno, tím více receptorů je fosforylováno. U β2-adrenergních receptorů má tato fosforylace za následek přechod vazby z G-proteinové třídy do Gi. Fosforylace zprostředkovaná cAMP-dependentním PKA může způsobit heterologní desenzibilizaci u jiných receptorů než těch aktivovaných.
G proteinem spřažené receptorové kinázy (GRKs) jsou proteinové kinázy, které fosforylují pouze[nutná citace] aktivní GPCR.
Mechanismy ukončení signálu GPCR
Jak je uvedeno výše, G-proteiny mohou ukončit svou vlastní aktivaci díky své vnitřní schopnosti GTP→GDP hydrolýzy. Tato reakce však probíhá pomalou rychlostí (≈.02 krát/s), a proto by trvalo přibližně 50 sekund, než by se jakýkoli jednotlivý G-protein deaktivoval, pokud by do hry nevstoupily další faktory. Ve skutečnosti existuje okolo 30 izoforem RGS proteinů, které při vazbě na Gα přes jejich GAP doménu zrychlují rychlost hydrolýzy na ≈30 krát/s. Toto 1500násobné zvýšení rychlosti umožňuje buňce reagovat na vnější signály vysokou rychlostí, stejně jako prostorovým rozlišením díky omezenému množství sekundového posla, který může být generován a omezená vzdálenost G-proteinu se může difundovat za 0,03 sekundy. Většinou jsou RGS proteiny promiskuitní ve své schopnosti aktivovat G-proteiny, zatímco to, které RGS je zapojeno do dané signalizační dráhy, se zdá být více určeno tkání a zapojeným GPCR než cokoliv jiného. Navíc proteiny RGS mají dodatečnou funkci zvýšení rychlosti výměny GTP-HDP v GPCR, (tj. jako jakýsi co-GEF) dále přispívající k časovému rozlišení GPCR signalizace.
Kromě toho může být znecitlivěna sama GPCR. K tomu může dojít jako:
Jakmile se β-arrestin naváže na GPCR, projde konformační změnou, která mu umožní sloužit jako lešenářský protein pro adaptérový komplex zvaný AP-2, který zase rekrutuje další protein zvaný klathrin. Pokud dostatečné množství receptorů v místní oblasti rekrutuje klathrin tímto způsobem, agregují se a membrána se uvnitř pupenů v důsledku interakcí mezi molekulami klathrinu, v procesu zvaném opsonizace. Jakmile je jamka odštípnuta, plazmatická membrána v důsledku působení dvou dalších proteinů zvaných amfihysin a dynamin, je nyní endocytární vezikul. V tomto bodě se molekuly adaptéru a klathrin oddělily a receptor je buď transportován zpět do plazmatické membrány nebo zacílen na lysosomy pro degradaci.
V kterémkoli bodě tohoto procesu mohou β-arrestiny také naverbovat jiné proteiny – například non-receptorovou tyrosinkinázu (nRTK), c-SRC – která může aktivovat ERK1/2, nebo jinou mitogenem aktivovanou proteinkinázu (MAPK) signalizující například fosforylací malé GTP-ázy, Ras, nebo naverbovat proteiny ERK kaskády přímo (tj. Raf-1, MEK, ERK-1/2), v kterémžto bodě je zahájena signalizace vzhledem k jejich vzájemné blízkosti. Dalším cílem c-SRC jsou molekuly dynaminu podílející se na endocytóze. Dynaminy polymerizují kolem krku příchozího váčku a jejich fosforylace c-SRC poskytuje energii potřebnou pro konformační změnu umožňující konečné „odštípnutí“ z membrány.
Receptorová desenzibilizace je zprostředkována pomocí kombinované fosforylace, vazby β-arr a endocytózy, jak je popsáno výše. Downregulace nastává, když je endocytosovaný receptor vložen do endozomu, který je obchodován, aby se spojil s organelou zvanou lysozom. Protože lysozomální membrány jsou bohaté na protonové pumpy, jejich interiéry mají nízké pH (≈4,8 oproti pH≈7,2 cytosolu), které působí na denaturaci GPCR. Navíc lysozomy obsahují mnoho degradačních enzymů, včetně proteáz, které mohou fungovat pouze při takto nízkém pH, a tak mohou být peptidové vazby spojující zbytky GPCR společně rozštěpeny. Zda je daný receptor obchodován do lysozomu, zadržen v endozomech nebo obchodován zpět do plazmatické membrány, závisí na celé řadě faktorů, včetně typu receptoru a velikosti signálu.
Regulace GPCR je navíc zprostředkována faktory genové transkripce. Tyto faktory mohou zvýšit nebo snížit genovou transkripci a tím zvýšit nebo snížit tvorbu nových receptorů (regulace nahoru nebo dolů), které putují do buněčné membrány.
Rozšířeným jevem je oligomerizace receptorů spřažených s G-proteinem. Jedním z nejlépe studovaných příkladů je metabotropní GABAB receptor. Tento tzv. konstitutivní receptor je tvořen heterodimerizací podjednotek GABABR1 a GABABR2. Exprese GABABR1 bez GABABR2 v heterologních systémech vede k retenci podjednotky v endoplazmatickém retikulu. Exprese samotné podjednotky GABABR2 vede k povrchové expresi podjednotky, i když bez funkční aktivity (tj. receptor neváže agonistu a nemůže iniciovat odpověď po expozici agonistovi). Exprese obou podjednotek společně vede k plazmatické membránové expresi funkčního receptoru. Bylo prokázáno, že vazba GABABR2 na GABABR1 způsobuje maskování retenčního signálu funkčních receptorů.
Vznik a diverzifikace nadrodiny
Signální transdukce zprostředkovaná nadrodinou GPCR sahá až k původu mnohobuněčnosti. GPCR podobné savcům se vyskytují v houbách a byly klasifikovány podle klasifikačního systému GRAFS založeného na otiscích prstů GPCR. Identifikace členů nadčeledi napříč eukaryotickou doménou a porovnání motivů specifických pro rodinu ukázaly, že nadčeleď GPCR má společný původ. Charakteristické motivy naznačují, že tři z pěti rodin GRAFS, rody Rhodopsin, Adhesion a Frizzled, se vyvinuly z receptorů Dictyostelium discoideum cAMP před rozdělením Opisthokonts. Později se rod Secretin vyvinul z rodiny receptorů Adhesion GPCR před rozdělením hlístic.
V Dictyostelium discoideum, které reguluje snímání buněčné hustoty, bylo nedávno identifikováno nové GPCR obsahující doménu lipid kinázy.