Obrázek 1. Během meiózy může homologní rekombinace vytvářet nové kombinace genů, jak je znázorněno na obrázku, mezi podobnými, ale ne identickými kopiemi lidského chromozomu 1.
Homologní rekombinace je typ genetické rekombinace, při níž dochází k výměně nukleotidových sekvencí mezi dvěma podobnými nebo stejnými molekulami DNA. Buňky ji nejčastěji využívají k přesné opravě škodlivých zlomů, které se vyskytují na obou vláknech DNA, tzv. dvouřetězcových zlomů. Homologní rekombinace také vytváří nové kombinace sekvencí DNA během meiózy, procesu, při kterém eukaryota vytvářejí gametové buňky, jako jsou spermie a vaječné buňky u živočichů. Tyto nové kombinace DNA představují genetickou variabilitu potomstva, která následně umožňuje populacím přizpůsobit se v průběhu evoluce. Homologní rekombinace se využívá také při horizontálním přenosu genů, kdy dochází k výměně genetického materiálu mezi různými kmeny a druhy bakterií a virů.
Ačkoli se homologní rekombinace u různých organismů a typů buněk značně liší, většina forem zahrnuje stejné základní kroky. Poté, co dojde k dvouřetězcovému zlomu, jsou úseky DNA kolem 5′ konců zlomu odříznuty v procesu zvaném resekce. V následujícím kroku invaze řetězce pak převislý 3′ konec přerušené molekuly DNA „napadne“ podobnou nebo identickou molekulu DNA, která není přerušena. Po invazi do vlákna spojí obě molekuly DNA jedna nebo dvě struktury ve tvaru kříže, které se nazývají Hollidayovy spoje. V závislosti na tom, jak jsou tyto dvě spojky přerušeny enzymy, dochází v meióze k homologní rekombinaci, jejímž výsledkem je buď chromozomální crossover, nebo non-crossover. Homologní rekombinace, ke které dochází při opravě DNA, má tendenci vést k nekřížícím produktům, což v podstatě obnovuje poškozenou molekulu DNA v podobě, v jaké existovala před dvouřetězcovým zlomem.
Homologní rekombinace je zachována ve všech třech oblastech života i u virů, což naznačuje, že se jedná o téměř univerzální biologický mechanismus. Objev genů pro homologní rekombinaci u protist – rozmanité skupiny eukaryotických mikroorganismů – byl interpretován jako důkaz, že meióza se objevila na počátku evoluce eukaryot. Vzhledem k tomu, že jejich dysfunkce byla silně spojena se zvýšenou náchylností k několika typům rakoviny, jsou proteiny, které usnadňují homologní rekombinaci, předmětem aktivního výzkumu. Homologní rekombinace se také využívá při genovém cílení, což je technika zavádění genetických změn do cílových organismů. Za vývoj této techniky získali Mario Capecchi, Martin Evans a Oliver Smithies v roce 2007 Nobelovu cenu za fyziologii nebo lékařství.
Obrázek 2. Raná ilustrace přejezdu od Thomase Hunta Morgana
Na počátku 20. století objevili William Bateson a Reginald Punnett výjimku z jednoho z principů dědičnosti, který původně popsal Gregor Mendel v 60. letech 19. století. Na rozdíl od Mendelovy představy, že znaky se při přenosu z rodičů na děti dědí nezávisle na sobě – například že barva srsti kočky a délka jejího ocasu se dědí nezávisle na sobě – ukázali Bateson a Punnett, že určité geny spojené s fyzickými znaky se mohou dědit společně neboli geneticky propojené. V roce 1911 Thomas Hunt Morgan poté, co si všiml, že spojené znaky mohou být občas děděny samostatně, navrhl, že mezi spojenými geny může docházet ke „křížení“, kdy jeden ze spojených genů fyzicky přechází na jiný chromozom. O dvě desetiletí později Barbara McClintocková a Harriet Creightonová prokázaly, že ke křížení chromozomů dochází během meiózy, procesu buněčného dělení, při kterém vznikají spermie a vajíčka. Ve stejném roce jako McClintocková Curt Stern ukázal, že ke křížení – později nazývanému „rekombinace“ – může docházet také v somatických buňkách, jako jsou bílé krvinky a kožní buňky, které se dělí mitózou.
V roce 1947 mikrobiolog Joshua Lederberg ukázal, že bakterie, o nichž se předpokládalo, že se rozmnožují pouze nepohlavně binárním dělením, jsou schopny genetické rekombinace, která se více podobá pohlavnímu rozmnožování. Díky této práci se bakterie E. coli stala modelovým organismem v genetice a Lederberg za ni v roce 1958 získal Nobelovu cenu za fyziologii nebo lékařství. Na základě studií u hub navrhl Robin Holliday v roce 1964 model rekombinace v meióze, který představil klíčové detaily fungování tohoto procesu, včetně výměny materiálu mezi chromozomy prostřednictvím Hollidayových spojů. V roce 1983 Jack Szostak a jeho kolegové představili model, který je nyní známý jako DSBR dráha a který vysvětluje pozorování, jež Hollidayův model nevysvětluje. Během následujícího desetiletí vedly experimenty na drozofilách, poupatech kvasinek a savčích buňkách ke vzniku dalších modelů homologní rekombinace, tzv. drah SDSA, které se ne vždy spoléhají na Hollidayovy spoje.
Homologní rekombinace je nezbytná pro dělení buněk u eukaryot, jako jsou rostliny, živočichové, houby a protisty. V buňkách, které se dělí mitózou, homologní rekombinace opravuje dvouřetězcové zlomy v DNA způsobené ionizujícím zářením nebo chemickými látkami poškozujícími DNA. Neopravené dvouřetězcové zlomy mohou způsobit rozsáhlé přeskupení chromozomů v somatických buňkách, což může vést ke vzniku rakoviny.
Kromě oprav DNA pomáhá homologní rekombinace také vytvářet genetickou rozmanitost, když se buňky dělí v meióze a stávají se specializovanými gametami – spermiemi nebo vajíčky u zvířat, pylem nebo vajíčky u rostlin a sporami u hub. Děje se tak tím, že usnadňuje chromozomální křížení, při němž se mezi homologními chromozomy vyměňují oblasti podobné, ale ne identické DNA. Vznikají tak nové, případně výhodné kombinace genů, které mohou potomkům přinést evoluční výhodu. Chromozomální křížení začíná, když protein zvaný Spo11 cíleně přeruší dvojřetězec DNA. Tato místa jsou na chromozomech umístěna ne náhodně; obvykle v intergenových promotorových oblastech a přednostně v doménách bohatých na GC Tato místa dvouřetězcových zlomů se často vyskytují v rekombinačních hotspotech, oblastech chromozomů, které jsou dlouhé přibližně 1 000-2 000 párů bází a mají vysokou míru rekombinace. Nepřítomnost rekombinačního hotspotu mezi dvěma geny na stejném chromozomu často znamená, že tyto geny budou budoucí generace dědit ve stejném poměru. To představuje vazbu mezi oběma geny větší, než by se dalo očekávat u genů, které se nezávisle asortovaly během meiózy.
Načasování v rámci buněčného cyklu
Obrázek 3. Homologní rekombinace opravuje DNA před vstupem buňky do mitózy (fáze M). Dochází k ní pouze během replikace DNA a krátce po ní, během fází S a G2 buněčného cyklu.
Dvojřetězcové zlomy mohou být opraveny homologní rekombinací nebo nehomologním spojováním (NHEJ). NHEJ je mechanismus opravy DNA, který na rozdíl od homologní rekombinace nevyžaduje dlouhou homologní sekvenci pro vedení opravy. O tom, zda se k opravě dvouřetězcových zlomů použije homologní rekombinace nebo NHEJ, do značné míry rozhoduje fáze buněčného cyklu. Homologní rekombinace opravuje DNA před vstupem buňky do mitózy (fáze M). Dochází k ní během replikace DNA a krátce po ní, ve fázích S a G2 buněčného cyklu, kdy jsou sesterské chromatidy snadněji dostupné. Ve srovnání s homologními chromozomy, které jsou podobné jinému chromozomu, ale často mají různé alely, jsou sesterské chromatidy ideální předlohou pro homologní rekombinaci, protože jsou identickou kopií daného chromozomu. Na rozdíl od homologní rekombinace převažuje NHEJ ve fázi G1 buněčného cyklu, kdy buňka roste, ale ještě není připravena k dělení. Po fázi G1 se vyskytuje méně často, ale udržuje si alespoň určitou aktivitu po celou dobu buněčného cyklu. Mechanismy, které regulují homologní rekombinaci a NHEJ v průběhu buněčného cyklu, se u různých druhů značně liší.
Cyklin-dependentní kinázy (CDK), které modifikují aktivitu jiných proteinů tím, že k nim přidávají fosfátové skupiny (tj. fosforylují je), jsou důležitými regulátory homologní rekombinace u eukaryot. Při zahájení replikace DNA u poupat kvasinek zahájí cyklin-dependentní kináza Cdc28 homologní rekombinaci fosforylací proteinu Sae2. Poté, co je takto aktivován přidáním fosfátu, použije Sae2 svou endonukleázovou aktivitu k provedení čistého řezu v blízkosti dvouřetězcového zlomu v DNA. To umožní třídílnému proteinu známému jako komplex MRX navázat se na DNA a zahájit sérii reakcí řízených proteinem, které vyměňují materiál mezi dvěma molekulami DNA.
Dva základní modely způsobu, jakým homologní rekombinace opravuje dvouřetězcové zlomy v DNA, jsou dráha DSBR (někdy nazývaná model dvojitého Hollidayova spoje) a dráha SDSA (synthesis-dependent strand annealing). Obě cesty jsou si podobné v několika prvních krocích. Po vzniku dvouřetězcového zlomu se komplex MRX (u člověka komplex MRN) naváže na DNA na obou stranách zlomu. Poté se ve dvou různých krocích provede resekce, při níž se zkrátí DNA kolem 5′ konců zlomu. V prvním kroku resekce se do komplexu MRX zapojí protein Sae2. Oba proteiny pak zkrátí 5′ konce na obou stranách zlomu a vytvoří krátké 3′ převisy jednořetězcové DNA. Ve druhém kroku pokračuje 5’→3′ resekce pomocí helikázy Sgs1 a nukleáz Exo1 a Dna2. Sgs1 jako helikáza „rozbaluje“ dvouřetězcovou DNA, zatímco nukleázová aktivita Exo1 a Dna2 jim umožňuje stříhat jednořetězcovou DNA vytvořenou Sgs1.
Obrázek 4. Dráhy DSBR a SDSA mají stejné počáteční kroky, ale poté se rozcházejí. Dráha DSBR nejčastěji vede ke křížení chromozomů (vlevo dole), zatímco SDSA vždy končí nekříženými produkty (vpravo dole).
Protein RPA, který má vysokou afinitu k jednořetězcové DNA, pak váže 3′ převisy. S pomocí několika dalších proteinů, které tento proces zprostředkovávají, pak protein Rad51 (a Dmc1 v meióze) vytvoří na jednom vlákně DNA pokrytém RPA vlákno z nukleové kyseliny a proteinu. Toto nukleoproteinové vlákno pak začne vyhledávat sekvence DNA podobné sekvenci 3′ převisu. Po nalezení takové sekvence se jednovláknové nukleoproteinové vlákno přesune do podobného nebo identického duplexu přijímající DNA (invaduje do něj) v procesu zvaném invaze do vlákna. V buňkách, které se dělí mitózou, je přijímajícím duplexem DNA obvykle sesterská chromatida, která je identická s poškozenou molekulou DNA a poskytuje šablonu pro opravu. V meióze však bývá přijímající DNA z podobného, ale ne nutně identického homologního chromozomu. Během invaze řetězce se mezi invadujícím 3′ převislým vláknem a homologním chromozomem vytvoří vytěsňovací smyčka (D-smyčka). Po invazi vlákna prodlužuje DNA polymeráza konec invadujícího 3′ vlákna syntézou nové DNA. Tím se D-smyčka změní na strukturu ve tvaru kříže známou jako Hollidayova spojka. Následně dojde k další syntéze DNA na invadujícím vlákně (tj. na jednom z původních 3′ převisů), čímž se účinně obnoví vlákno na homologním chromozomu, které bylo během invaze vlákna přemístěno.
Po fázích resekce, invaze vlákna a syntézy DNA se cesty DSBR a SDSA od sebe odlišují. Dráha DSBR je jedinečná v tom, že druhý 3′ převis (který nebyl zapojen do invaze vlákna) také tvoří Hollidayovu spojku s homologním chromozomem. Dvojité Hollidayovy spoje jsou pak přeměněny na produkty rekombinace pomocí nicking endonukleáz, což je typ restrikční endonukleázy, která stříhá pouze jedno vlákno DNA. Dráha DSBR běžně vede ke crossoveru, i když někdy může vést i k nekrosoverovým produktům; schopnost zlomené molekuly DNA shromažďovat sekvence z oddělených donorových lokusů byla prokázána u mitotických poupat kvasinek pomocí plazmidů nebo endonukleázové indukce chromozomálních událostí. Vzhledem k této tendenci ke křížení chromozomů je dráha DSBR pravděpodobným modelem toho, jak dochází k homologní rekombinaci během meiózy.
O tom, zda rekombinace v dráze DSBR vede k chromozomálnímu crossoveru, rozhoduje způsob, jakým je dvojitý Hollidayův spoj přerušen nebo „vyřešen“. K chromozomálnímu crossoveru dojde, pokud je jeden Hollidayův spoj přerušen na křížícím se vlákně a druhý Hollidayův spoj je přerušen na nekřížícím se vlákně (na obrázku 4 podél vodorovných fialových šipek na jednom Hollidayově spoji a podél svislých oranžových šipek na druhém). Alternativně, pokud jsou oba Hollidayovy spoje přerušeny na křížících se vláknech (podél vodorovných fialových šipek na obou Hollidayových spojích na obrázku 4), pak vzniknou chromozomy bez křížení.
Homologní rekombinace cestou SDSA probíhá v buňkách, které se dělí mitózou, a jejím výsledkem jsou nekřížící se produkty. V tomto modelu je invadující 3′ vlákno prodlouženo podél duplexu recipientní DNA pomocí DNA polymerázy a je uvolněno, když se Hollidayova spojka mezi molekulami donorové a recipientní DNA posune v procesu zvaném migrace větví. Nově syntetizovaný 3′ konec invadujícího vlákna je pak schopen se přichytit k druhému 3′ převisu v poškozeném chromozomu prostřednictvím komplementárního párování bází. Po spojení vláken může někdy zůstat malý klopný úsek DNA. Všechny takové chlopně jsou odstraněny a cesta SDSA končí opětovným zalepením, známým také jako ligace, všech zbývajících jednořetězcových mezer.
Obrázek 5. Rekombinace cestou SSA probíhá mezi dvěma opakujícími se elementy (fialová barva) na stejném duplexu DNA a vede k delecím genetického materiálu. (Kliknutím zobrazíte animovaný diagram v prohlížečích Firefox, Chrome, Safari nebo Opera.)
Jak se DNA kolem dvouřetězcového zlomu zkracuje, vznikající jednořetězcové 3′ převisy se obalují proteinem RPA, který zabraňuje tomu, aby se 3′ převisy k sobě přilepily. Protein zvaný Rad52 pak naváže každou z opakovaných sekvencí na obou stranách zlomu a zarovná je tak, aby se obě komplementární opakované sekvence mohly spojit. Po dokončení žíhání jsou zbytky nehomologních chlopní 3′ převisů odříznuty sadou nukleáz známých jako Rad1/Rad10, které jsou k chlopním přivedeny proteiny Saw1 a Slx4. Syntéza nové DNA vyplní všechny mezery a ligace obnoví duplex DNA jako dvě souvislá vlákna. Sekvence DNA mezi repeticemi je vždy ztracena, stejně jako jedna z obou repetic. Dráha SSA je považována za mutagenní, protože vede k takovým delecím genetického materiálu.
Během replikace DNA může někdy dojít k dvouřetězcovým zlomům na replikačních vidlicích, protože DNA helikáza rozpojuje templátové vlákno. Tyto defekty jsou opravovány cestou homologní rekombinace (BIR). Přesné molekulární mechanismy cesty BIR zůstávají nejasné. Tři navržené mechanismy mají jako počáteční krok invazi vlákna, ale liší se v tom, jak modelují migraci smyčky D a pozdější fáze rekombinace.
Dráha BIR může také pomáhat udržovat délku telomer (oblastí DNA na konci eukaryotických chromozomů) bez telomerázy (nebo ve spolupráci s ní). Bez funkčních kopií enzymu telomerázy se telomery obvykle zkracují s každým cyklem mitózy, což nakonec blokuje buněčné dělení a vede ke stárnutí. V buňkách poupat kvasinek, kde byla telomeráza inaktivována mutacemi, byly pozorovány dva typy „přeživších“ buněk, které se senescenci vyhýbají déle, než se očekávalo, tím, že prodlužují své telomery cestou BIR.
Udržování délky telomer je klíčové pro nesmrtelnost buněk, která je klíčovým znakem rakoviny. Většina nádorů udržuje telomery regulací telomerázy. U několika typů lidských nádorů však dráha podobná BIR pomáhá udržovat některé nádory tím, že funguje jako alternativní mechanismus udržování telomer. Tato skutečnost vedla vědce ke zkoumání, zda by takové mechanismy udržování telomer založené na rekombinaci mohly zmařit protirakovinné léky, jako jsou inhibitory telomerázy.
Obrázek 6. Krystalová struktura dvou řetězců proteinu RecA navázaných na DNA. Je vidět dvouřetězcový zlom a dva sousední 3′ převisy.
Homologní rekombinace je hlavní proces opravy DNA u bakterií. Je také důležitá pro vytváření genetické rozmanitosti v bakteriálních populacích, i když se tento proces podstatně liší od meiotické rekombinace, která přináší rozmanitost v eukaryotických genomech. Homologní rekombinace byla nejvíce studována a je nejlépe známa u Escherichia coli. Dvouřetězcové zlomy DNA se u bakterií opravují cestou homologní rekombinace RecBCD. Předpokládá se, že zlomy, které se vyskytují pouze na jednom ze dvou vláken DNA, tzv. jednovláknové mezery, jsou opravovány cestou RecF. Jak cesta RecBCD, tak cesta RecF zahrnují sérii reakcí známých jako migrace větví, při níž dochází k výměně jednoho vlákna DNA mezi dvěma zkříženými molekulami duplexní DNA, a rezoluce, při níž jsou tyto dvě zkřížené molekuly DNA od sebe odděleny a obnoveny do normálního dvouvláknového stavu.
Obrázek 7A. Molekulární model rekombinační cesty RecBCD. Tento model je založen na reakcích DNA a RecBCD s ATP v přebytku nad ionty Mg2+. Krok 1: RecBCD se váže na dvouřetězcový konec DNA. Krok 2: RecBCD odvíjí DNA. RecD je rychlá helikáza na 5′-koncovém vlákně a RecB je pomalejší helikáza na 3′-koncovém vlákně (to s hrotem šipky) [odkaz 46 v aktuální verzi Wiki]. Vznikají tak dva jednovláknové (ss) ocasy DNA a jedna ss smyčka. Smyčka a ocásky se zvětšují, jak se RecBCD pohybuje podél DNA. Krok 3: Dva ocásky se spojí a vytvoří druhou ss smyčku DNA a obě smyčky se pohybují a rostou. Krok 4: Po dosažení sekvence Chi hotspot (5′ GCTGGTGG 3′; červená tečka) RecBCD přeruší 3′-koncové vlákno. Dalším odvíjením vznikne dlouhý 3′-koncový ss chvost s Chi poblíž jeho konce. Krok 5: RecBCD načte protein RecA na ocas Chi. V blíže neurčeném okamžiku se podjednotky RecBCD rozloží. Krok 6: Komplex RecA-ssDNA vnikne do neporušené homologní duplexní DNA a vytvoří smyčku D, kterou lze rozdělit na neporušenou rekombinantní DNA dvěma způsoby. Krok 7: D-smyčka se rozřízne a annealizuje se s mezerou v první DNA, čímž vznikne Hollidayův spoj. Rozlišení Hollidayova spoje (řezání, výměna vláken a ligace) v místě otevřených šipek určitou kombinací RuvABC a RecG vytváří dva rekombinanty recipročního typu. Krok 9: 3′ konec Chi chvostu je základem syntézy DNA, z níž může vzniknout replikační vidlička. Rozlišením vidlice v místě otevřených šipek vznikne jedna rekombinantní (nereciproční) DNA, jedna DNA rodičovského typu a jeden fragment DNA.
Obrázek 7B. Začátek dráhy RecBCD. Tento model je založen na reakcích DNA a RecBCD s ionty Mg2+ v přebytku nad ATP. Krok 1: RecBCD se váže na dvouřetězcový zlom DNA. Krok 2: RecBCD iniciuje odvíjení duplexu DNA prostřednictvím helikázové aktivity závislé na ATP. Krok 3: RecBCD pokračuje v odvíjení a postupuje po duplexu DNA, přičemž štěpí 3′ vlákno mnohem častěji než 5′ vlákno. Krok 4: RecBCD narazí na Chi sekvenci a přestane štěpit 3′ vlákno; štěpení 5′ vlákna se výrazně zvýší. Krok 5: RecBCD načte RecA na 3′ vlákno. Krok 6: RecBCD se odpoutá od duplexu DNA a na 3′ vlákně zůstane nukleoproteinové vlákno RecA.
Dráha RecBCD je hlavní rekombinační dráha používaná v bakteriích k opravě dvouřetězcových zlomů DNA. Tyto dvouřetězcové zlomy mohou být způsobeny UV zářením a jiným zářením, stejně jako chemickými mutageny. Dvouřetězcové zlomy mohou také vzniknout replikací DNA přes jednovláknový zářez nebo mezeru. Taková situace způsobuje tzv. zhroucení replikační vidlice a je napravována několika cestami homologní rekombinace včetně cesty RecBCD.
V této cestě iniciuje rekombinaci komplex tří enzymových podjednotek zvaný RecBCD, který se váže na tupý nebo téměř tupý konec zlomu ve dvouřetězcové DNA. Poté, co RecBCD naváže konec DNA, začnou podjednotky RecB a RecD rozbalovat duplex DNA pomocí helikázové aktivity. Podjednotka RecB má také nukleázovou doménu, která odřízne jedno vlákno DNA, jež vznikne při rozpojování. Toto rozbalování pokračuje, dokud RecBCD nenarazí na specifickou sekvenci nukleotidů (5′-GCTGGTGG-3′) známou jako místo Chi.
Při setkání s místem Chi se aktivita enzymu RecBCD dramaticky změní. Odvíjení DNA se na několik sekund zastaví a poté se obnoví zhruba poloviční rychlostí oproti počátečnímu stavu. To je pravděpodobně způsobeno tím, že pomalejší helikáza RecB odvíjí DNA po Chi, nikoliv rychlejší helikáza RecD, která odvíjí DNA před Chi. Rozpoznání místa Chi také změní enzym RecBCD tak, že odřízne vlákno DNA s Chi a začne načítat více proteinů RecA na jednořetězcovou DNA s nově vytvořeným 3′ koncem. Vzniklé nukleoproteinové vlákno obalené RecA pak vyhledává podobné sekvence DNA na homologním chromozomu. Proces vyhledávání vyvolává natahování duplexu DNA, což zlepšuje rozpoznávání homologie (mechanismus označovaný jako konformační proofreading ). Po nalezení takové sekvence se jednovláknové nukleoproteinové vlákno přesune do homologního duplexu přijímající DNA v procesu zvaném invaze vláken. Invaze 3′ převisu způsobí posunutí jednoho z vláken duplexu přijímající DNA a vytvoření D-smyčky. Pokud je smyčka D přerušena, další výměna vláken vytvoří strukturu ve tvaru kříže, která se nazývá Hollidayova spojka. Rozřešení Hollidayova spoje určitou kombinací RuvABC nebo RecG může vést ke vzniku dvou rekombinantních molekul DNA s recipročními genetickými typy, pokud se obě interagující molekuly DNA geneticky liší. Alternativně může invazivní 3′ konec v blízkosti Chi spustit syntézu DNA a vytvořit replikační vidličku. Při tomto typu rozlišení vzniká pouze jeden typ rekombinantu (nereciproční).
Zdá se, že bakterie používají k opravě jednořetězcových mezer v DNA cestu homologní rekombinace RecF. Pokud je cesta RecBCD inaktivována mutacemi a další mutace inaktivují nukleázy SbcCD a ExoI, může cesta RecF opravovat také dvouřetězcové zlomy DNA. V dráze RecF helikáza RecQ odvíjí DNA a nukleáza RecJ degraduje vlákno s 5′ koncem, přičemž vlákno s 3′ koncem zůstává neporušené. Na toto vlákno se váže protein RecA, kterému buď pomáhají proteiny RecF, RecO a RecR, nebo je jimi stabilizován. Nukleoproteinové vlákno RecA pak vyhledá homologní DNA a vymění si místo s identickým nebo téměř identickým vláknem v homologní DNA.
Ačkoli se proteiny a specifické mechanismy zapojené do jejich počátečních fází liší, obě cesty jsou si podobné v tom, že obě vyžadují jednořetězcovou DNA s 3′ koncem a protein RecA pro invazi do vlákna. Dráhy jsou si podobné také ve fázích migrace větví, kdy se Hollidayův spoj posouvá jedním směrem, a rozuzlení, kdy jsou Hollidayovy spoje od sebe odštěpeny enzymy. Alternativní, nereciproční typ rezoluce může také probíhat oběma cestami.
Bezprostředně po invazi vláken se Hollidayova spojka pohybuje podél spojené DNA během procesu migrace větví. Při tomto pohybu Hollidayova spoje dochází k výměně párů bází mezi dvěma homologními duplexy DNA. Pro katalyzování migrace větví protein RuvA nejprve rozpozná a naváže se na Hollidayovu spojku a rekrutuje protein RuvB, který vytvoří komplex RuvAB. Dvě sady proteinu RuvB, z nichž každá tvoří prstencovou ATPázu, jsou vloženy na opačné strany Hollidayova spoje, kde fungují jako dvojité pumpy, které zajišťují sílu pro migraci větví. Mezi těmito dvěma prstenci RuvB se ve středu Hollidayovy křižovatky shromáždí dvě sady bílkovin RuvA, takže DNA na křižovatce je umístěna mezi každou sadou RuvA. Vlákna obou duplexů DNA – „dárcovského“ a „přijímacího“ duplexu – se odvíjejí na povrchu RuvA, když jsou vedena proteinem z jednoho duplexu do druhého.
Ve fázi rozlišení rekombinace jsou všechny Hollidayovy spoje vzniklé při invazi vláken přerušeny, čímž se obnoví dvě oddělené molekuly DNA. Toto štěpení se provádí interakcí komplexu RuvAB s RuvC, které společně tvoří komplex RuvABC. RuvC je endonukleáza, která stříhá degenerovanou sekvenci 5′-(A/T)TT(G/C)-3′. Tato sekvence se v DNA vyskytuje často, přibližně jednou za 64 nukleotidů. Před řezáním RuvC pravděpodobně získá přístup k Hollidayově křižovatce tím, že vytlačí jeden ze dvou tetramerů RuvA, které zde pokrývají DNA. Výsledkem rekombinace jsou buď „splice“, nebo „patch“ produkty, podle toho, jak RuvC Hollidayovu spojku rozštěpí. Splice produkty jsou produkty crossoveru, při nichž dochází k přeskupení genetického materiálu v okolí místa rekombinace. Naproti tomu produkty typu „patch“ jsou nekřížící se produkty, u nichž k takovému přeskupení nedochází a v produktu rekombinace je pouze „záplata“ hybridní DNA.
Usnadnění genetického přenosu
Homologní rekombinace je důležitou metodou integrace dárcovské DNA do genomu přijímajícího organismu při horizontálním přenosu genů, což je proces, při kterém organismus začleňuje cizí DNA z jiného organismu, aniž by byl jeho potomkem. Homologní rekombinace vyžaduje, aby příchozí DNA byla velmi podobná genomu příjemce, a proto je horizontální přenos genů obvykle omezen na podobné bakterie. Studie na několika druzích bakterií prokázaly, že s rostoucím rozdílem v sekvenci mezi hostitelskou a přijímající DNA dochází k log-lineárnímu poklesu frekvence rekombinace.
Při bakteriální konjugaci, kdy se DNA přenáší mezi bakteriemi přímým kontaktem mezi buňkami, pomáhá homologní rekombinace integrovat cizí DNA do hostitelského genomu cestou RecBCD. Enzym RecBCD podporuje rekombinaci poté, co je DNA během replikace přeměněna z jednořetězcové DNA – v této podobě se původně dostala do bakterie – na dvouřetězcovou DNA. Dráha RecBCD je také nezbytná pro závěrečnou fázi transdukce, což je typ horizontálního přenosu genů, při kterém je DNA přenášena z jedné bakterie do druhé pomocí viru. Cizí bakteriální DNA je někdy chybně začleněna do kapsidové hlavičky bakteriofágové virové částice, když je DNA během virové replikace zabalena do nových bakteriofágů. Když tyto nové bakteriofágy infikují jiné bakterie, je DNA z předchozí hostitelské bakterie vnesena do nového bakteriálního hostitele jako dvouvláknová DNA. Enzym RecBCD pak tuto dvouřetězcovou DNA začlení do genomu nového bakteriálního hostitele.
Homologní rekombinace se vyskytuje u několika skupin virů. U DNA virů, jako je herpesvirus, dochází k rekombinaci mechanismem break-and-rejoin podobně jako u bakterií a eukaryot. Existují také důkazy o rekombinaci u některých RNA virů, konkrétně u pozitivně smysluplných ssRNA virů, jako jsou retroviry, pikornaviry a koronaviry. O tom, zda k homologní rekombinaci dochází u negativních ssRNA virů, jako je chřipka, se vedou spory.
U RNA virů může být homologní rekombinace buď přesná, nebo nepřesná. Při přesném typu rekombinace RNA-RNA není žádný rozdíl mezi dvěma rodičovskými sekvencemi RNA a výslednou kříženou oblastí RNA. Z tohoto důvodu je často obtížné určit místo křížení mezi dvěma rekombinujícími sekvencemi RNA. Při nepřesné homologní rekombinaci RNA má křížící se oblast určitý rozdíl oproti rodičovským sekvencím RNA – způsobený buď přidáním, odstraněním, nebo jinou modifikací nukleotidů. Úroveň přesnosti při křížení je řízena sekvenčním kontextem obou rekombinujících řetězců RNA: sekvence bohaté na adenin a uracil snižují přesnost křížení.
Homologní rekombinace je důležitá pro usnadnění virové evoluce. Pokud například genomy dvou virů s různými nevýhodnými mutacemi projdou rekombinací, mohou být schopny regenerovat plně funkční genom. Případně, pokud dva podobné viry infikovaly stejnou hostitelskou buňku, může homologní rekombinace umožnit těmto dvěma virům vyměnit si geny, a tím vyvinout silnější varianty sebe sama.
Homologní rekombinace je navrhovaný mechanismus, kterým se DNA virus lidského herpesviru-6 integruje do lidských telomer.
Bez správné homologní rekombinace se chromozomy v první fázi buněčného dělení v meióze často nesprávně uspořádají. To způsobuje, že se chromozomy správně nesegregují v procesu zvaném nedisjunkce. Nondisjunkce může způsobit, že spermie a vajíčka mají příliš málo nebo příliš mnoho chromozomů. Downův syndrom, který je způsoben nadbytečnou kopií chromozomu 21, je jednou z mnoha abnormalit, které jsou důsledkem selhání homologní rekombinace v meióze.
Nedostatky v homologní rekombinaci jsou silně spojeny se vznikem rakoviny u lidí. Například každé z nádorových onemocnění Bloomův syndrom, Wernerův syndrom a Rothmund-Thomsonův syndrom je způsobeno nefunkčními kopiemi genů helikázy RecQ, které se podílejí na regulaci homologní rekombinace: BLM, WRN a RECQ4. V buňkách pacientů s Bloomovým syndromem, kterým chybí funkční kopie proteinu BLM, dochází ke zvýšené míře homologní rekombinace. Pokusy na myších s nedostatkem BLM naznačují, že tato mutace vede ke vzniku rakoviny v důsledku ztráty heterozygozity způsobené zvýšenou homologní rekombinací. Ztráta heterozygotnosti znamená ztrátu jedné ze dvou verzí – nebo alel – genu. Pokud jedna ze ztracených alel pomáhá potlačovat nádory, jako například gen pro retinoblastomový protein, pak ztráta heterozygozity může vést ke vzniku rakoviny:1236.
Snížená míra homologní rekombinace způsobuje neúčinnou opravu DNA, což může vést k rakovině. To je případ genů BRCA1 a BRCA2, dvou podobných tumor supresorových genů, jejichž špatná funkce je spojena s výrazně zvýšeným rizikem rakoviny prsu a vaječníků. Buňky, kterým chybí BRCA1 a BRCA2, mají sníženou míru homologní rekombinace a zvýšenou citlivost na ionizující záření, což naznačuje, že snížená homologní rekombinace vede ke zvýšené náchylnosti k rakovině. Vzhledem k tomu, že jedinou známou funkcí BRCA2 je pomáhat iniciovat homologní rekombinaci, vědci spekulují, že podrobnější znalost role BRCA2 v homologní rekombinaci může být klíčem k pochopení příčin rakoviny prsu a vaječníků.
Obrázek 8. Proteinové domény v proteinech souvisejících s homologní rekombinací jsou konzervovány napříč třemi hlavními skupinami života: archei, bakteriemi a eukaryoty.
Na základě podobnosti jejich aminokyselinových sekvencí se předpokládá, že sady proteinů zapojených do homologní rekombinace mají společný evoluční původ. Jedním z takových souborů proteinů je rodina proteinů RecA/Rad51, která zahrnuje protein RecA z bakterií, proteiny Rad51 a Dmc1 z eukaryot a proteiny RadA a RadB z archeí. Tyto proteiny hrají klíčovou roli v počátečních fázích homologní rekombinace v organismech, které je exprimují. Proteiny rodiny RecA/Rad51 sdílejí dlouhou konzervovanou oblast známou jako doména RecA/Rad51. V rámci této proteinové domény se nacházejí dva sekvenční motivy, Walkerův motiv A a Walkerův motiv B. Motivy Walker A a B umožňují členům rodiny proteinů RecA/Rad51 zapojit se do hydrolýzy ATP, která poskytuje proteinům energii pro reakce při homologní rekombinaci.
Studie modelující evoluční vztahy mezi proteiny Rad51, Dmc1 a RadA naznačují, že jsou monofyletické nebo že mají společného molekulárního předka. V rámci této rodiny proteinů jsou Rad51 a Dmc1 seskupeny v samostatném kladě od RadA. Jedním z důvodů pro seskupení těchto tří proteinů je, že všechny mají směrem ke svému N-konci modifikovaný motiv šroubovice-otočná šroubovice, který pomáhá proteinům vázat se na DNA. Jako pravděpodobný původ moderních genů RAD51 a DMC1 byla navržena dávná genová duplikace eukaryotického genu RecA a následná mutace.
Objevení Dmc1 u několika druhů Giardia, jednoho z prvních protist, kteří se rozdělili na eukaryota, naznačuje, že meiotická homologní rekombinace – a tedy i samotná meióza – se objevila velmi brzy v evoluci eukaryot. Kromě výzkumu Dmc1 poskytly informace o původu meiotické rekombinace také studie proteinu Spo11. Spo11 je topoizomeráza typu II, která iniciuje homologní rekombinaci v meióze tím, že vytváří cílené dvouřetězcové zlomy v DNA. Fylogenetické stromy založené na sekvenci genů podobných SPO11 u živočichů, hub, rostlin, protist a archeí vedly vědce k domněnce, že verze Spo11, která se v současnosti vyskytuje u eukaryot, vznikla u posledního společného předka eukaryot a archeí.
Technologické aplikace
Obrázek 9. Jako vyvíjející se embryo měla tato chimérická myš gen pro barvu srsti aguti vnesený do DNA pomocí genového cílení. Její potomci jsou homozygotní pro gen aguti.
Mnoho metod vnášení sekvencí DNA do organismů za účelem vytvoření rekombinantní DNA a geneticky modifikovaných organismů využívá proces homologní rekombinace. Tato metoda, nazývaná také cílení genů, je běžná zejména v genetice kvasinek a myší. Metoda genového cílení u knockoutovaných myší využívá myší embryonální kmenové buňky k dodání umělého genetického materiálu (většinou terapeutického zájmu), který potlačuje cílový gen myši na principu homologní rekombinace. Myš tak slouží jako pracovní model pro pochopení účinků konkrétního savčího genu. Za svůj objev, jak lze homologní rekombinaci využít k zavádění genetických modifikací u myší prostřednictvím embryonálních kmenových buněk, získali Mario Capecchi, Martin Evans a Oliver Smithies v roce 2007 Nobelovu cenu za fyziologii nebo medicínu.
Pokroky v technologiích cílení genů, které využívají homologní rekombinační mechanismy buněk, nyní vedou k vývoji nové vlny přesnějších izogenních modelů lidských onemocnění. Předpokládá se, že tyto upravené modely lidských buněk přesněji odrážejí genetiku lidských onemocnění než jejich předchůdci na myších. Je tomu tak především proto, že do endogenních genů jsou vnášeny zájmové mutace, stejně jako se vyskytují u skutečných pacientů, a že jsou založeny na lidských genomech, nikoli na genomech potkanů. Kromě toho některé technologie umožňují spíše vyřazení určité mutace než jen vyřazení spojené se staršími technologiemi cílení genů.
Proteinové inženýrství s homologní rekombinací vytváří chimérické proteiny výměnou fragmentů mezi dvěma rodičovskými proteiny. Tyto techniky využívají skutečnosti, že rekombinace může vnést vysokou míru sekvenční rozmanitosti a zároveň zachovat schopnost proteinu skládat se do terciární struktury neboli trojrozměrného tvaru.[80] To je v protikladu k jiným technikám proteinového inženýrství, jako je náhodná bodová mutageneze, u níž pravděpodobnost zachování funkce proteinu exponenciálně klesá s rostoucím počtem aminokyselinových záměn.[81] Chiméry vytvořené rekombinačními technikami jsou schopny zachovat si schopnost skládat se, protože jejich vyměněné rodičovské fragmenty jsou strukturně a evolučně konzervované. Tyto rekombinovatelné „stavební bloky“ zachovávají strukturně důležité interakce, jako jsou body fyzického kontaktu mezi různými aminokyselinami ve struktuře proteinu. K identifikaci strukturních podjednotek vhodných pro rekombinaci lze použít výpočetní metody, jako je SCHEMA a statistická spojovací analýza[82][83][84].
Techniky založené na homologní rekombinaci byly použity k vytvoření nových proteinů.Ve studii publikované v roce 2007 se vědcům podařilo vytvořit chiméry dvou enzymů, které se podílejí na biosyntéze isoprenoidů, což je rozmanitá skupina sloučenin zahrnující hormony, vizuální pigmenty a některé feromony. Chimérické proteiny získaly schopnost katalyzovat zásadní reakci v biosyntéze isoprenoidů – jedné z nejrozmanitějších cest biosyntézy, které se v přírodě vyskytují -, která v mateřských proteinech chyběla.[85] Proteinové inženýrství pomocí rekombinace také vytvořilo chimérické enzymy s novou funkcí u členů skupiny proteinů známé jako rodina cytochromů P450,[86] která se u lidí podílí na detoxikaci cizorodých sloučenin, jako jsou léky, potravinářské přísady a konzervační látky.
Rakovinné buňky s mutacemi BRCA mají nedostatky v homologní rekombinaci a byly vyvinuty léky, které tyto nedostatky využívají a úspěšně se používají v klinických studiích.Olaparib, inhibitor PARP1, zmenšil nebo zastavil růst nádorů prsu, vaječníků a prostaty způsobených mutacemi v genech BRCA1 nebo BRCA2. Geny BRCA1 a BRCA2 jsou nezbytné pro opravu DNA homologní rekombinací. Pokud geny BRCA1 nebo BRCA2 chybí, jiný typ mechanismu opravy DNA zvaný oprava excizí bází obvykle kompenzuje nedostatek opravy DNA homologní rekombinací. Bázově-excizní reparace využívá protein PARP1. Rakovinné buňky s nedostatkem BRCA tedy přežívají pouze s jedním mechanismem opravy DNA. Když je inhibován protein PARP1, je inhibován i tento druhý opravný mechanismus, oprava DNA je drasticky omezena a buňka umírá[87].
Tím, že olaparib zastavuje opravu DNA tímto způsobem, uplatňuje koncept syntetické letality a cíleně se zaměřuje na rakovinné buňky. Využití syntetické letality je novým směrem ve vývoji protinádorových léčiv.[87] Přestože inhibitory PARP1 představují nový přístup k léčbě rakoviny, vědci upozorňují, že se mohou ukázat jako nedostatečné pro léčbu pozdních stadií metastazujících nádorů.[87] Rakovinné buňky se mohou stát rezistentními vůči inhibitoru PARP1, pokud u nich dojde k deleci mutací v BRCA2. To oslabuje syntetickou smrtelnost léku tím, že obnovuje schopnost rakovinných buněk opravovat DNA homologní rekombinací[89].