Poškození DNA vedoucí k mnohočetným zlomům chromozomů
Oprava DNA je soubor procesů, kterými buňka identifikuje a koriguje poškození molekul DNA, které kódují její genom. V lidských buňkách mohou jak normální metabolické aktivity, tak faktory prostředí, jako je UV záření a záření, způsobit poškození DNA, což má za následek až 1 milion jednotlivých molekulárních lézí na buňku denně. Mnohé z těchto lézí způsobují strukturální poškození molekuly DNA a mohou změnit nebo eliminovat schopnost buňky přepisovat gen, který postižená DNA kóduje. Jiné léze indukují potenciálně škodlivé mutace v genomu buňky, které ovlivňují přežití jejích dceřiných buněk poté, co podstoupí mitózu. V důsledku toho je proces opravy DNA neustále aktivní, protože reaguje na poškození struktury DNA. Když selžou normální procesy opravy a když nedojde k buněčné apoptóze, může dojít k nenapravitelnému poškození DNA, včetně dvouvláknových zlomů a křížových vazeb DNA (interstrand crosslinks nebo ICL).
Schopnost opravy DNA buňky je životně důležitá pro integritu jejího genomu, a tím i pro její normální fungování a fungování organismu. Ukázalo se, že mnoho genů, u nichž bylo zpočátku prokázáno, že ovlivňují délku života, se podílí na nápravě a ochraně poškození DNA. Neschopnost napravit molekulární léze v buňkách, které tvoří gamety, může vnést mutace do genomů potomstva, a tím ovlivnit rychlost vývoje.
K poškození DNA v důsledku environmentálních faktorů a normálních metabolických procesů uvnitř buňky dochází rychlostí 1 000 až 1 000 000 molekulárních lézí na buňku denně. I když to představuje pouze 0,000165% z přibližně 6 miliard bází lidského genomu (3 miliardy párů bází), neopravené léze v kritických genech (jako jsou geny potlačující nádorová onemocnění) mohou bránit schopnosti buňky vykonávat její funkci a znatelně zvýšit pravděpodobnost vzniku nádoru.
Drtivá většina poškození DNA ovlivňuje primární strukturu dvoušroubovice; to znamená, že samotné báze jsou chemicky modifikovány. Tyto modifikace mohou zase narušit pravidelnou šroubovicovou strukturu molekul zavedením nepůvodních chemických vazeb nebo objemných adduktů, které se nevejdou do standardní dvoušroubovice. Na rozdíl od proteinů a RNA DNA obvykle postrádá terciální strukturu, a proto k poškození nebo narušení na této úrovni nedochází. DNA je však superspirálová a ovinutá kolem „obalových“ proteinů zvaných histony (u eukaryot) a obě nadstavby jsou zranitelné vůči následkům poškození DNA.
Replikace poškozené DNA před dělením buněk může vést k inkorporaci nesprávných bází proti poškozeným. Dceřiné buňky, které zdědí tyto nesprávné báze, nesou mutace, z nichž je původní sekvence DNA neopravitelná (s výjimkou vzácného případu zpětné mutace, například prostřednictvím genové konverze).
Škody způsobené exogenními činiteli se vyskytují v mnoha formách. Některé příklady jsou:
UV poškození, alkylace/metylace, poškození rentgenem a oxidační poškození jsou příklady indukovaného poškození. Spontánní poškození může zahrnovat ztrátu báze, deaminaci, svraštění cukerného kruhu a tautomerický posun.
Poškození jaderné versus mitochondriální DNA
V lidských buňkách a eukaryotických buňkách obecně se DNA nachází na dvou buněčných místech – uvnitř jádra a uvnitř mitochondrií. Nukleární DNA (nDNA) existuje jako chromatin v nereplikačních fázích buněčného cyklu a je kondenzována do agregovaných struktur známých jako chromozomy během buněčného dělení. V obou stavech je DNA silně komprimována a navinuta kolem proteinů podobných perličkám zvaných histony. Kdykoli buňka potřebuje vyjádřit genetickou informaci zakódovanou ve své nDNA, je rozpletena požadovaná chromozomální oblast, jsou exprimovány geny v ní umístěné a poté je oblast kondenzována zpět do klidové konformace. Mitochondriální DNA (mtDNA) se nachází uvnitř mitochondriálních organel, existuje ve více kopiích a je také úzce spojena s řadou proteinů, aby vytvořila komplex známý jako nukleoid. Uvnitř mitochondrií, reaktivních druhů kyslíku (ROS), neboli volných radikálů, vedlejších produktů stálé produkce adenosintrifosfátu (ATP) oxidativní fosforylací, se vytváří vysoce oxidativní prostředí, o kterém je známo, že poškozuje mtDNA. Kritickým enzymem pro neutralizaci toxicity těchto druhů je superoxiddismutáza, která je přítomna jak v mitochondriích, tak v cytoplazmě eukaryotických buněk.
Senescence, nevratný stav, ve kterém se buňka již nedělí, je ochranná reakce na zkracování konců chromozomů. Telomery jsou dlouhé oblasti opakující se nekódující DNA, které uzavírají chromozomy a procházejí částečnou degradací pokaždé, když buňka podstoupí dělení (viz Hayflickův limit). Oproti tomu quiescence je reverzibilní stav buněčné dormance, který nesouvisí s poškozením genomu (viz buněčný cyklus). Senescence v buňkách může sloužit jako funkční alternativa k apoptóze v případech, kdy je fyzická přítomnost buňky z prostorových důvodů vyžadována organismem, který slouží jako mechanismus „poslední záchrany“ k zabránění nevhodné replikaci buňky s poškozenou DNA v nepřítomnosti prorůstové buněčné signalizace. Neregulované dělení buňky může vést ke vzniku nádoru (viz rakovina), který je pro organismus potenciálně smrtelný. Proto je indukce senescence a apoptózy považována za součást strategie ochrany proti rakovině.
Je důležité rozlišovat mezi poškozením DNA a mutací, dvěma hlavními typy chyb v DNA. Poškození DNA a mutace se zásadně liší. Poškození jsou fyzické abnormality v DNA, jako jsou jednovláknové a dvouvláknové zlomy, zbytky 8-hydroxydeoxyguanosinu a polycyklické aromatické uhlovodíkové addukty. Poškození DNA mohou rozpoznat enzymy, a proto mohou být správně opraveny, pokud jsou k dispozici nadbytečné informace, jako je nepoškozená sekvence v komplementárním řetězci DNA nebo v homologickém chromozomu, ke kopírování. Pokud si buňka zachová poškození DNA, lze zabránit transkripci genu, a tudíž bude zablokován i překlad do proteinu. Replikace může být také zablokována a/nebo buňka může zemřít.
Vzhledem k těmto vlastnostem poškození a mutace DNA lze pozorovat, že poškození DNA je zvláštní problém v nedělících se nebo pomalu se dělících buňkách, kde se neopravené poškození bude časem spíše hromadit. Na druhou stranu v rychle se dělících buňkách může neopravené poškození DNA, které nezabije buňku zablokováním replikace, způsobit chyby v replikaci a tím i mutaci. Velká většina mutací, které nejsou ve svém účinku neutrální, je škodlivá pro přežití buňky. V populaci buněk, které tvoří tkáň s replikujícími se buňkami, tak budou mít mutované buňky tendenci se ztrácet. Nicméně vzácné mutace, které poskytují výhodu přežití, budou mít tendenci klonálně se rozšiřovat na úkor sousedních buněk v tkáni. Tato výhoda pro buňku je nevýhodná pro celý organismus, protože takové mutované buňky mohou vyvolat rakovinu. Poškození DNA v často se dělících buňkách, protože způsobují mutace, jsou tedy prominentní příčinou rakoviny. Naopak poškození DNA v zřídka se dělících buňkách jsou pravděpodobně prominentní příčinou stárnutí.
Jednovláknové a dvouvláknové poškození DNA
Buňky nemohou fungovat, pokud poškození DNA narušuje integritu a přístupnost základních informací v genomu (ale buňky zůstávají povrchně funkční, pokud tzv. „nedůležité“ geny chybí nebo jsou poškozeny). V závislosti na typu poškození způsobené na dvoušroubovité struktuře DNA se vyvinuly různé opravné strategie, jak ztracenou informaci obnovit. Pokud je to možné, buňky používají jako šablonu pro obnovu původní informace nemodifikované doplňkové vlákno DNA nebo sesterskou chromatidu. Bez přístupu k šabloně buňky používají jako poslední možnost mechanismus obnovy náchylný k chybám známý jako syntéza translézí.
Poškození DNA mění prostorovou konfiguraci šroubovice a takové změny mohou být buňkou detekovány. Jakmile je poškození lokalizováno, specifické molekuly opravy DNA se navážou v místě poškození nebo v jeho blízkosti, což vyvolá vazbu dalších molekul a vytvoří komplex, který umožní skutečnou opravu.
Je známo, že buňky eliminují tři typy poškození své DNA chemickou reverzí. Tyto mechanismy nevyžadují šablonu, protože typy poškození, proti kterým působí, se mohou vyskytnout pouze v jedné ze čtyř bází. Takové mechanismy přímého reverzu jsou specifické pro typ vzniklého poškození a nezahrnují porušení fosfodiesterové páteře. Tvorba pyrimidinových dimerů po ozáření UV světlem má za následek abnormální kovalentní vazbu mezi sousedními pyrimidinovými bázemi. Proces fotoreaktivace toto poškození přímo zvrátí působením enzymu fotolyázy, jehož aktivace je povinně závislá na energii absorbované modrým/UV světlem (vlnová délka 300–500 nm) za účelem podpory katalýzy. Další typ poškození, metylace guaninových bází, je přímo zvrácen proteinem methyl guanin methyl transferázou (MGMT), jehož bakteriální ekvivalent se nazývá ogt. Jedná se o nákladný proces, protože každá molekula MGMT může být použita pouze jednou; to znamená, že reakce je spíše stechiometrická než katalytická. Zobecněná reakce na metylační činidla u bakterií je známá jako adaptivní reakce a poskytuje úroveň rezistence na alkylační činidla při trvalé expozici upregulací alkylačních reparačních enzymů. Třetím typem poškození DNA zvráceného buňkami je určitá metylace bází cytosinu a adeninu.
Struktura reparačního enzymu uracil-DNA glykosylázy. Zbytek uracilu je znázorněn žlutě.
Pokud má vadu pouze jeden ze dvou pramenů dvoušroubovice, může být druhý pramen použit jako šablona pro korekci poškozeného pramene. Aby bylo možné opravit poškození jedné ze dvou párových molekul DNA, existuje řada excizních opravných mechanismů, které odstraní poškozený nukleotid a nahradí jej nepoškozeným nukleotidem doplňujícím ten, který se nachází v nepoškozeném řetězci DNA.
Dvouvláknové přestávky, při nichž jsou oba prameny v dvoušroubovici přerušeny, jsou pro buňku zvláště nebezpečné, protože mohou vést k přeskupení genomu. Existují tři mechanismy, jak opravit dvouvláknové přestávky (DSB): nehomologické koncové spojování (NHEJ), mikrohomologií zprostředkované koncové spojování (MMEJ) a homologní rekombinace. PVN Acharya poznamenala, že dvouvláknové přestávky a „křížové spojování spojující oba prameny ve stejném bodě je neopravitelné, protože ani jeden pramen pak nemůže sloužit jako předloha pro opravu. Buňka zemře při příští mitóze nebo v některých vzácných případech mutuje.“
DNA ligasa, která napravuje poškození chromozomů, je enzym, který spojuje porušené nukleotidy katalyzací tvorby esterové vazby internukleotidu mezi fosfátovou páteří a nukleotidy deoxyribosy.
V NHEJ se DNA Ligase IV, specializovaná DNA ligáza, která tvoří komplex s kofaktorem XRCC4, přímo spojuje oba konce. Pro přesnou opravu se NHEJ spoléhá na krátké homologní sekvence zvané mikrohomologie přítomné na jednovláknových koncích DNA, které mají být spojeny. Pokud jsou tyto převisy kompatibilní, oprava je obvykle přesná. NHEJ může také zavést mutace během opravy. Ztráta poškozených nukleotidů v místě zlomu může vést k delecím a spojením neodpovídajících koncových buněk se vytvoří translokace. NHEJ je zvláště důležitý před tím, než buňka replikuje svou DNA, protože není k dispozici žádná šablona pro opravu homologní rekombinací. Ve vyšších eukaryotech existují „záložní“ NHEJ dráhy. Kromě své role správce genomu je NHEJ nutný pro spojení vlásenkou zakončených dvouvláknových zlomů indukovaných během V(D)J rekombinace, procesu, který generuje rozmanitost B-buněk a T-buněčných receptorů v imunitním systému obratlovců.
Homologní rekombinace vyžaduje přítomnost identické nebo téměř identické sekvence, která se použije jako předloha pro opravu zlomu. Enzymatické zařízení zodpovědné za tento proces opravy je téměř identické se zařízením zodpovědným za chromozomální přechod během meiózy. Tato cesta umožňuje opravit poškozený chromozom pomocí sesterské chromatidy (dostupné v G2 po replikaci DNA) nebo homologního chromozomu jako předlohy. DSB způsobené replikačním zařízením pokoušejícím se syntetizovat přes jednovláknovou zlom nebo neopravenou lézi způsobují kolaps replikační vidlice a obvykle se opravují rekombinací.
Topoisomerázy zavádějí jak jednovláknové, tak dvouvláknové zlomy v průběhu změny stavu supercívky DNA, což je běžné zejména v oblastech v blízkosti otevřené replikační vidlice. Takové zlomy se nepovažují za poškození DNA, protože jsou přirozeným meziproduktem v biochemickém mechanismu topoizomerázy a jsou okamžitě opraveny enzymy, které je vytvořily.
Tým francouzských výzkumníků bombardoval Deinococcus radiodurans, aby studoval mechanismus opravy dvouvláknové zlomové DNA v tomto organismu. Nejméně dvě kopie genomu s náhodnými zlomy DNA mohou žíháním vytvořit fragmenty DNA. Částečně se překrývající fragmenty jsou pak použity pro syntézu homologických oblastí prostřednictvím pohyblivé D-smyčky, která může pokračovat v prodlužování, dokud nenajdou komplementární partnerské řetězce. V posledním kroku dochází ke křížení pomocí RecA-dependentní homologické rekombinace.
Translesion synthesis (TLS) je proces tolerance poškození DNA, který umožňuje replikačnímu aparátu DNA replikovat minulé DNA léze, jako jsou thyminové dimery nebo AP místa. Zahrnuje výměnu pravidelných DNA polymeráz za specializované translesion polymerázy (tj. DNA polymeráza IV nebo V, z rodiny Y Polymerase), často s většími aktivními místy, která mohou usnadnit vkládání bází proti poškozeným nukleotidům. Předpokládá se, že polymerázové přepínání je zprostředkováno, mimo jiné, posttranslační modifikací replikačního procesivitního faktoru PCNA. Translesion synthesis polymerázy mají často nízkou věrnost (vysoký sklon k vkládání nesprávných bází) na nepoškozených šablonách oproti běžným polymerázám. Mnohé z nich jsou však extrémně efektivní při vkládání správných bází proti specifickým typům poškození. Například Pol η zprostředkovává bezchybný bypass lézí vyvolaných UV ozářením, zatímco Pol ι zavádí mutace na těchto místech. Je známo, že Pol η přidává první adenin napříč T^T fotodimerem pomocí Watson-Crickova párování bází a druhý adenin bude přidán v jeho synkonformaci pomocí Hoogsteenova párování bází. Z buněčného pohledu může být riskování zavedení bodových mutací během syntézy translézí vhodnější než uchýlení se k drastičtějším mechanismům opravy DNA, které mohou způsobit hrubé chromozomální aberace nebo buněčnou smrt. Stručně řečeno, tento proces zahrnuje specializované polymerázy, které buď obcházejí nebo opravují léze v místech zastavené replikace DNA. Například lidská DNA polymeráza eta může obejít komplexní DNA léze jako guanin-thymin intra-strand crosslink, G[8,5-Me]T, i když může způsobit cílené a polocílené mutace. Paromita Raychaudhury a Ashis Basu studovali toxicitu a mutagenezi stejné léze u E.coli replikací G[8,5-Me]T-modifikovaného plazmidu u Escherichia coli se specifickými DNA polymerázovými knockouty. Životaschopnost byla velmi nízká u kmene postrádajícího pol II, pol IV a pol V, tři SOS indukovatelné DNA polymerázy, což naznačuje, že translézní syntéza je prováděna primárně těmito specializovanými DNA polymerázami.
Těmto polymerázám je poskytována bypassová platforma pomocí proliferujícího buněčného nukleárního antigenu (PCNA). Za normálních okolností PCNA navázaná na polymerázy replikuje DNA. V místě léze je PCNA ubiquitinována, nebo modifikována proteiny RAD6/RAD18, aby poskytla platformu pro specializované polymerázy, které by obešly lézi a obnovily replikaci DNA. Po translézní syntéze je nutné rozšíření. Toto rozšíření lze provést replikační polymerázou, pokud je TLS bezchybná, jako v případě Pol η, přesto pokud TLS vyústí v nesoulad, je k jeho rozšíření nutná specializovaná polymeráza; Pol ζ. Pol ζ je unikátní v tom, že může rozšířit terminální nesoulad, zatímco procesnější polymerázy ne. Takže když se objeví léze, replikační vidlice se zastaví, PCNA přejde z procesivní polymerázy na TLS polymerázu, jako je Pol ζ pro fixaci léze, pak PCNA může přejít na Pol ζ pro rozšíření neshody a poslední PCNA přejde na procesivní polymerázu pro pokračování replikace.
Globální reakce na poškození DNA
Buňky vystavené ionizujícímu záření, ultrafialovému světlu nebo chemikáliím jsou náchylné k získání více míst objemných lézí DNA a dvouvláknových zlomů. Látky poškozující DNA navíc mohou poškodit další biomolekuly, jako jsou proteiny, sacharidy, lipidy a RNA. Hromadění poškození, abychom byli konkrétní, dvouvláknové zlomy nebo addukty zastavující replikační vidličky, patří mezi známé stimulační signály globální reakce na poškození DNA. Globální reakce na poškození je aktem směřujícím k vlastní konzervaci buněk a spouští více cest makromolekulární opravy, bypass lézí, toleranci nebo apoptózu. Společnými rysy globální reakce jsou indukce více genů, zástava buněčného cyklu a inhibice dělení buněk.
Po poškození DNA jsou aktivovány kontrolní body buněčného cyklu. Aktivace kontrolního bodu pozastavuje buněčný cyklus a dává buňce čas na nápravu poškození před dalším dělením. Kontrolní body poškození DNA se vyskytují na hranicích G1/S a G2/M. Existuje také kontrolní bod intra-S. Aktivace kontrolního bodu je řízena dvěma hlavními kinázami, ATM a ATR. ATM reaguje na dvouvláknové zlomy DNA a narušení struktury chromatinu, zatímco ATR primárně reaguje na zastavené replikační vidlice. Tyto kinázy fosforylují dolní cíle v signální transdukční kaskádě, což nakonec vede k zástavě buněčného cyklu. Byla také identifikována třída proteinů mediátoru kontrolních bodů včetně BRCA1, MDC1 a 53BP1. Zdá se, že tyto proteiny jsou potřebné pro přenos signálu aktivace kontrolního bodu na dolní proteiny.
Důležitým navazujícím cílem ATM a ATR je p53, protože je potřebný pro vyvolání apoptózy po poškození DNA. Inhibitor kinázy závislý na cyklinu p21 je indukován mechanismy závislými na p53 i nezávisle na p53 a může zastavit buněčný cyklus v kontrolních bodech G1/S a G2/M deaktivací kinázových komplexů závislých na cyklinu.
Prokaryotická SOS odpověď
SOS odpověď je změna exprese genů u Escherichia coli a dalších bakterií v reakci na rozsáhlé poškození DNA. Prokaryotický SOS systém je regulován dvěma klíčovými proteiny: LexA a RecA. LexA homodimer je transkripční represor, který se váže na operátorské sekvence běžně označované jako SOS boxy. U Escherichia coli je známo, že LexA reguluje transkripci přibližně 48 genů včetně genů lexA a recA. O SOS odpovědi je známo, že je rozšířená v Bacteria doméně, ale většinou se nevyskytuje u některých bakteriálních fyl, jako jsou Spirochety.
Nejčastějšími buněčnými signály aktivujícími SOS odpověď jsou oblasti jednovláknové DNA (ssDNA), vznikající ze zastavených replikačních vidliček nebo dvouvláknových zlomů, které jsou zpracovány DNA helikázou k oddělení obou řetězců DNA. V iniciačním kroku se protein RecA váže na ssDNA v reakci řízené hydrolýzou ATP, která vytváří RecA-ssDNA vlákna. Vlákna RecA-ssDNA aktivují autoproteázovou aktivitu LexA, což nakonec vede k štěpení LexA dimeru a následné degradaci LexA. Ztráta LexA represoru indukuje transkripci genů SOS a umožňuje další indukci signálu, inhibici buněčného dělení a zvýšení hladin proteinů zodpovědných za zpracování poškození.
V Escherichia coli jsou SOS boxy dvacetinukleotidové dlouhé sekvence v blízkosti promotorů s palindromickou strukturou a vysokým stupněm zachování sekvence. V jiných třídách a fyle se sekvence SOS boxů značně liší, s různou délkou a složením, ale je vždy vysoce konzervovaná a patří k nejsilnějším krátkým signálům v genomu. Vysoký informační obsah SOS boxů umožňuje diferenciální vazbu LexA na různé promotory a umožňuje načasování SOS odpovědi. Geny pro opravu lézí jsou indukovány na začátku SOS odpovědi. V krajním případě jsou později indukovány translační polymerázy náchylné k chybám, například UmuCD’2 (také nazývaná DNA polymeráza V). Jakmile je poškození DNA opraveno nebo bypass pomocí polymeráz nebo pomocí rekombinace, množství jednovláknové DNA v buňkách se sníží, snížením množství RecA vláken se sníží štěpná aktivita LexA homodimeru, který se pak naváže na SOS boxy v blízkosti promotorů a obnoví normální expresi genu.
Eukaryotické transkripční reakce na poškození DNA
Eukaryotické buňky vystavené látkám poškozujícím DNA také aktivují důležité obranné dráhy navozením více proteinů podílejících se na opravě DNA, kontrole buněčného cyklu, obchodu s proteiny a jejich degradaci. Taková celogenomová transkripční odpověď je velmi složitá a přísně regulovaná, což umožňuje koordinovanou globální reakci na poškození. Vystavení kvasinek Saccharomyces cerevisiae látkám poškozujícím DNA má za následek překrývající se, ale odlišné transkripční profily. Podobnosti s reakcí na šok prostředí naznačují, že na úrovni transkripční aktivace existuje obecná globální dráha reakce na stres. Oproti tomu různé typy lidských buněk reagují na poškození různě, což naznačuje absenci společné globální reakce. Pravděpodobné vysvětlení tohoto rozdílu mezi kvasinkami a lidskými buňkami může být v heterogenitě savčích buněk. U zvířete jsou různé typy buněk distribuovány mezi různé orgány, u kterých se vyvinula různá citlivost na poškození DNA.
Obecně globální reakce na poškození DNA zahrnuje expresi více genů zodpovědných za opravu po replikaci, homologní rekombinaci, opravu excize nukleotidů, kontrolní bod poškození DNA, globální transkripční aktivaci, geny kontrolující rozpad mRNA a mnoho dalších. Velké množství poškození buňky ji staví před důležité rozhodnutí: podstoupit apoptózu a zemřít, nebo přežít za cenu života s modifikovaným genomem. Zvýšení tolerance k poškození může vést ke zvýšené míře přežití, která umožní větší akumulaci mutací. Kvasinky Rev1 a lidská polymeráza η jsou členy [Y rodiny translézí DNA polymeráz přítomných během globální reakce na poškození DNA a jsou zodpovědné za zvýšenou mutagenezi během globální reakce na poškození DNA u eukaryot.
Patologické účinky špatné opravy DNA
Rychlost opravy DNA je důležitým determinantem buněčné patologie
Experimentální zvířata s genetickými nedostatky v opravách DNA často vykazují sníženou délku života a zvýšenou incidenci rakoviny. Například myši s nedostatkem dominantní NHEJ dráhy a v mechanismech udržování telomer dostávají lymfomy a infekce častěji a v důsledku toho mají kratší délku života než myši divokého typu. Podobným způsobem mají myši s nedostatkem klíčového opravárenského a transkripčního proteinu, který odvíjí šroubovice DNA, předčasný nástup nemocí souvisejících se stárnutím a následné zkrácení délky života. Ne každý nedostatek opravy DNA však vytváří přesně předpokládané účinky; myši s nedostatkem NER dráhy vykazovaly zkrácenou délku života bez odpovídající vyšší míry mutace.
Pokud míra poškození DNA přesáhne schopnost buňky ji opravit, nahromadění chyb může buňku zahltit a vést k časnému stáří, apoptóze nebo rakovině. Dědičná onemocnění spojená s vadnou funkcí opravy DNA mají za následek předčasné stárnutí, zvýšenou citlivost na karcinogeny a odpovídajícím způsobem zvýšené riziko rakoviny (viz níže). Na druhé straně organismy se zdokonalenými systémy opravy DNA, jako je Deinococcus radiodurans, nejznámější známý organismus odolný vůči záření, vykazují pozoruhodnou odolnost vůči dvouvláknovým zlomovým účinkům radioaktivity, pravděpodobně díky zvýšené účinnosti opravy DNA a zejména NHEJ.
Dlouhověkost a kalorické omezení
Většina délky života ovlivňující geny ovlivňují rychlost poškození DNA
Bylo identifikováno několik jednotlivých genů, které ovlivňují změny v délce života v populaci organismů. Účinky těchto genů jsou silně závislé na životním prostředí, zejména na stravě organismu. Kalorické omezení má u různých organismů za následek prodloužení životnosti, pravděpodobně prostřednictvím dráhy snímání živin a snížené metabolické rychlosti. Molekulární mechanismy, kterými takové omezení vede k prodloužení životnosti, jsou zatím nejasné (viz některé diskuze); nicméně chování mnoha genů, o nichž je známo, že se podílejí na opravě DNA, je za podmínek kalorického omezení změněno.
Například zvýšení dávkování genu SIR-2, který reguluje balení DNA v hlísticovém červu Caenorhabditis elegans, může významně prodloužit délku života. Je známo, že savčí homolog SIR-2 indukuje následné opravné faktory DNA zapojené do NHEJ, což je aktivita, která je zvláště podporována v podmínkách kalorické restrikce. Kalorická restrikce úzce souvisí s rychlostí opravy excize báze v jaderné DNA hlodavců, i když podobné účinky nebyly pozorovány v mitochondriální DNA.
Je zajímavé poznamenat, že gen C. elegans AGE-1, předcházející efektor cest opravy DNA, propůjčuje dramaticky prodlouženou délku života v podmínkách volného krmení, ale vede ke snížení reprodukční způsobilosti v podmínkách kalorického omezení. Toto pozorování podporuje teorii pleiotropie o biologickém původu stárnutí, která naznačuje, že geny poskytující velkou výhodu přežití v raném věku budou vybrány, i když nesou odpovídající nevýhodu v pozdním věku.
Modulace medicíny a oprav DNA
Poruchy dědičné opravy DNA
Vady v mechanismu NER jsou zodpovědné za několik genetických poruch, včetně:
Mentální retardace často doprovází poslední dvě poruchy, což naznačuje zvýšenou zranitelnost vývojových neuronů.
Všechny výše uvedené nemoci se často nazývají „segmentální progerias“ („nemoci urychleného stárnutí“), protože jejich oběti vypadají starší a trpí chorobami souvisejícími se stárnutím v abnormálně mladém věku, přičemž se neprojevují všechny příznaky stáří.
Mezi další nemoci spojené se sníženou funkcí opravy DNA patří Fanconiho anémie, dědičná rakovina prsu a dědičná rakovina tlustého střeva.
Kvůli inherentním omezením mechanismů opravy DNA, pokud by lidé žili dostatečně dlouho, všichni by nakonec onemocněli rakovinou. Existuje nejméně 34 dědičných genových mutací pro opravu lidské DNA, které zvyšují riziko rakoviny. Mnoho z těchto mutací způsobuje, že oprava DNA je méně účinná, než je obvyklé. Zejména dědičný nepolypózní kolorektální karcinom (HNPCC) je silně spojen se specifickými mutacemi v cestě opravy nesouladu DNA. BRCA1 a BRCA2, dva slavné geny, jejichž mutace přenašečům propůjčují obrovsky zvýšené riziko rakoviny prsu, jsou oba spojeny s velkým počtem cest opravy DNA, zejména NHEJ a homologní rekombinace.
Postupy protinádorové terapie, jako je chemoterapie a radioterapie, fungují tak, že zahltí schopnost buňky opravit poškození DNA, což vede k buněčné smrti. Přednostně jsou postiženy buňky, které se dělí nejrychleji – nejčastěji nádorové buňky. Vedlejším účinkem je, že jsou postiženy i další nenádorové, ale rychle se dělící buňky, jako jsou kmenové buňky v kostní dřeni. Moderní protinádorová léčba se snaží lokalizovat poškození DNA buněk a tkání spojené pouze s nádorovým onemocněním, a to buď fyzikálními prostředky (koncentrace léčebného prostředku v oblasti nádoru), nebo biochemickými prostředky (využití rysu jedinečného pro nádorové buňky v těle).
Epigenetické poruchy opravy DNA u rakoviny
Klasicky se na rakovinu pohlíží jako na soubor nemocí, které jsou poháněny progresivními genetickými abnormalitami, které zahrnují mutace genů potlačujících nádorová onemocnění a onkogenů a chromozomální aberace. Nicméně se ukázalo, že rakovina je také poháněna
epigenetickými změnami.
Epigenetické změny se týkají funkčně relevantních modifikací genomu, které nezahrnují změnu v sekvenci nukleotidů. Příkladem takových modifikací jsou změny v metylaci DNA (hypermetylace a hypomethylace) a modifikaci histonu, změny v chromozomální architektuře (způsobené nevhodnou expresí proteinů, jako jsou HMGA2 nebo HMGA1) a změny způsobené mikroRNA. Každá z těchto epigenetických modifikací slouží k regulaci genové exprese bez změny základní sekvence DNA. Tyto změny obvykle zůstávají prostřednictvím buněčného dělení, trvají po více buněčných generací a lze je považovat za epimutace (ekvivalent mutací).
Zatímco u nádorů se vyskytuje velké množství epigenetických změn, zvláště důležité se zdají být epigenetické změny v genech pro opravy DNA, které způsobují sníženou expresi proteinů pro opravy DNA. Má se za to, že k takovým změnám dochází v raném stadiu progrese rakoviny a jsou pravděpodobnou příčinou genetické nestability charakteristické pro nádory.
Snížená exprese opravárenských genů DNA způsobuje nedostatečnou opravu DNA. Je-li oprava DNA nedostatečná, zůstává poškození DNA v buňkách na vyšší než obvyklé úrovni a tato nadměrná poškození způsobují zvýšenou frekvenci mutací a/nebo epimutací. Míra mutací se podstatně zvyšuje u buněk vadných při opravách neshody DNA nebo při homologní rekombinační opravě (HRR). Chromozomální přestavby a aneuploidie také zvyšují počet vadných buněk HRR.
Vyšší úroveň poškození DNA způsobuje nejen zvýšenou mutaci, ale také zvýšenou epimutaci. Při opravě dvouvláknových zlomů DNA nebo opravě jiných poškození DNA mohou neúplně vyčištěná místa opravy způsobit umlčení epigenetického genu.
Nedostatečná exprese DNA reparačních proteinů v důsledku dědičné mutace může způsobit zvýšené riziko nádorového onemocnění. Jedinci s dědičným poškozením některého z 34 genů pro reparace DNA (viz článek Porucha reparačního deficitu DNA) mají zvýšené riziko nádorového onemocnění, přičemž některé vady mohou způsobit až 100% celoživotní pravděpodobnost nádorového onemocnění (např. mutace p53). Takové zárodečné mutace (které způsobují vysoce penetrační nádorové syndromy) jsou však příčinou pouze asi 1 procenta nádorových onemocnění.
Frekvence epimutací v opravných genech DNA
Graf běžných látek poškozujících DNA, léze, které způsobují v DNA, cesty opravy využité k opravě těchto lézí, mnoho genů v těchto cestách, indikace, které geny jsou regulovány epigeneticky, a které z těchto epigeneticky regulovaných genů se nacházejí se sníženou expresí u různých druhů rakoviny.
Nedostatky v DNA reparačních enzymech jsou občas způsobeny nově vzniklou somatickou mutací v genu pro reparaci DNA, ale mnohem častěji jsou způsobeny epigenetickými změnami, které snižují nebo umlčují expresi DNA reparačních genů. Například když bylo postupně vyšetřeno 113 kolorektálních karcinomů, pouze čtyři měly missense mutaci v genu pro reparaci DNA MGMT, zatímco většina měla sníženou expresi MGMT kvůli metylaci promotorové oblasti MGMT (epigenetická změna). Pět různých studií zjistilo, že 40 až 90 % kolorektálních karcinomů má sníženou expresi MGMT kvůli metylaci promotorové oblasti MGMT.
Obdobně ze 119 případů neshodných kolorektálních karcinomů s deficitem opravy, které postrádaly expresi genu pro opravu DNA PMS2, byla v 6 případech PMS2 nedostatečná kvůli mutacím v genu PMS2, zatímco ve 103 případech byla exprese PMS2 nedostatečná, protože její partnerský pár MLH1 byl potlačen kvůli promotorové metylaci (protein PMS2 je při absenci MLH1 nestabilní). V dalších 10 případech byla ztráta exprese PMS2 pravděpodobně způsobena epigenetickou nadměrnou expresí mikroRNA, miR-155, která MLH1 reguluje.
V dalších příkladech [uvedených v tabulkách v článku Epigenetika (viz sekce „DNA reparační epigenetika u nádorových onemocnění“)] byly zjištěny epigenetické defekty s frekvencí mezi 13%-100% u genů pro opravy DNA BRCA1, WRN, FANCB, FANCF, MGMT, MLH1, MSH2, MSH4, ERCC1, XPF, NEIL1 a ATM. Tyto epigenetické defekty se vyskytly u různých nádorů (např. prsu, vaječníků, kolorekta a hlavy a krku). Dva nebo tři nedostatky v expresi ERCC1, XPF a/nebo PMS2 se vyskytují současně u většiny ze 49 nádorů tlustého střeva hodnocených Facistou a kol.
Graf v této části ukazuje některé časté látky poškozující DNA, příklady lézí DNA, které způsobují, a cesty, které se s těmito poškozeními DNA vypořádávají. Nejméně 169 enzymů je buď přímo použito při opravách DNA, nebo ovlivňují procesy oprav DNA. Z toho 83 je přímo použito v 5 typech procesů oprav DNA, které jsou znázorněny v grafu. V grafu jsou také znázorněny lépe studované geny, které jsou pro tyto procesy oprav klíčové. Jak ukazují geny oprav DNA znázorněné červeně, mnoho genů v těchto cestách oprav je regulováno epigenetickými mechanismy a ty jsou u různých druhů rakoviny často redukovány nebo mlčí (označeny hvězdičkou). Dva přehledové články a dva obsáhlé články z experimentálního průzkumu[80] dokumentují většinu těchto epigenetických nedostatků oprav DNA.
Zdá se, že epigenetické změny v DNA reparačních genů jsou ústředním faktorem karcinogeneze.
Základní procesy opravy DNA jsou vysoce konzervovány jak mezi prokaryoty a eukaryoty, tak i mezi bakteriofágy (viry, které infikují bakterie); složitější organismy se složitějšími genomy však mají odpovídajícím způsobem složitější opravné mechanismy.[81] Schopnost velkého množství strukturních motivů bílkovin katalyzovat příslušné chemické reakce hrála významnou roli při vypracování opravných mechanismů během evoluce. Extrémně podrobný přehled hypotéz týkajících se vývoje opravy DNA viz.[82]
Fosilní záznamy naznačují, že jednobuněčný život se na planetě začal množit někdy v období prekambria, i když je nejasné, kdy přesně se zřetelně moderní život poprvé objevil. Nukleové kyseliny se staly jediným a univerzálním prostředkem kódování genetické informace, což vyžadovalo mechanismy opravy DNA, které ve své základní formě zdědily všechny existující formy života po svém společném předkovi. Vznik atmosféry Země bohaté na kyslík (známé jako „kyslíková katastrofa“) v důsledku fotosyntetických organismů, stejně jako přítomnost potenciálně škodlivých volných radikálů v buňce v důsledku oxidativní fosforylace, si vyžádaly vývoj mechanismů opravy DNA, které působí specificky proti typům poškození vyvolaných oxidačním stresem.
Rychlost evoluční změny
V některých případech není poškození DNA napraveno, nebo je napraveno mechanismem náchylným k chybám, který má za následek změnu oproti původní sekvenci. Když k tomu dojde, mohou se mutace šířit do genomů potomstva buňky. Pokud by k takové události došlo v zárodečné liniové buňce, která nakonec vytvoří gametu, má mutace potenciál být přenesena na potomstvo organismu. Rychlost vývoje u konkrétního druhu (nebo, v konkrétním genu) je funkcí rychlosti mutace. V důsledku toho má rychlost a přesnost mechanismů opravy DNA vliv na proces evoluční změny.[83]