Vysoké magnetické pole (800 MHz) NMR spektrometru Pacific Northwest National Laboratory je zatíženo vzorkem.
Proteinová nukleární magnetická rezonanční spektroskopie, zkráceně protein NMR je obor strukturní biologie, který aplikuje nukleární magnetickou rezonanční spektroskopii při zkoumání proteinů. Cílem je získat informace o struktuře a dynamice zkoumaných proteinů. Průkopníkem tohoto oboru byl mimo jiné Kurt Wüthrich, který v roce 2002 získal Nobelovu cenu, a je neustále využíván a zdokonalován jak v akademické sféře, tak v biotechnologickém průmyslu. Stanovení struktury nukleární magnetickou rezonanční spektroskopií se obvykle skládá z několika následujících fází, z nichž každá využívá samostatný soubor vysoce specializovaných technik. Vzorek se připraví, přiřadí se rezonance, vygenerují se zádržné systémy a vypočítá se a validuje struktura.
Vzorek NMR se připravuje v tenkostěnné skleněné trubici.
Vyčištěný protein se obvykle rozpustí v pufru a upraví na požadované podmínky rozpouštědla.
Protein NMR využívá multidimenzionální experimenty nukleární magnetické rezonance k získání informací o proteinu. V ideálním případě každé odlišné jádro v molekule zažívá odlišné chemické prostředí, a tak má odlišný chemický posun, podle kterého může být rozpoznáno. Nicméně u velkých molekul, jako jsou proteiny, může být počet rezonancí typicky několik tisíc a jednorozměrné spektrum má nevyhnutelně náhodné překrytí. Proto jsou prováděny multidimenzionální experimenty, které korelují frekvence odlišných jader. Dodatečné dimenze snižují pravděpodobnost překrytí a mají větší informační obsah, protože korelují signály z jader v určité části molekuly. Magnetizace se přenáší mezi jádry pomocí radiofrekvenčních pulsů a zpoždění prostřednictvím jedné z mnoha propracovaných pulsních sekvencí, které umožňují detekovat spojení mezi různými jádry. Soubor experimentů jaderné magnetické rezonance používaných na proteinech spadá do dvou hlavních kategorií – jedna, kde se magnetizace přenáší přes chemické vazby, a druhá, kde se přenos děje prostorem, bez ohledu na vazebnou strukturu. První kategorie se používá k přiřazení různých chemických posunů ke konkrétnímu jádru a druhá se primárně používá ke generování omezení vzdálenosti používaných při výpočtu struktury a při přiřazení s neoznačeným proteinem.
V závislosti na koncentraci vzorku, na magnetickém poli spektrometru a na typu experimentu může jeden multidimenzionální experiment nukleární magnetické rezonance na proteinovém vzorku trvat hodiny nebo i několik dní, než se pomocí průměrování signálu získá vhodný poměr signálu a šumu a umožní se dostatečný vývoj magnetizačního přenosu různými rozměry experimentu. Za jinak stejných podmínek budou experimenty s vyššími rozměry trvat déle než experimenty s nižšími rozměry.
Typicky prvním experimentem, který se měří s izotopem značeným proteinem, je spektrum 2D heteronukleární jednoduché kvantové korelace (HSQC), kde „heteronukleární“ označuje jádra jiná než 1H. Teoreticky má heteronukleární jednoduchá kvantová korelace jeden vrchol pro každé H vázané na heteronukleus. V 15N-HSQC se tedy očekává jeden signál pro každé reziduum aminokyseliny spolu s některými dalšími signály pro některé postranní řetězce obsahující N, jako je například tryptofan. 15N-HSQC je často označován jako otisk prstu proteinu, protože každý protein má jedinečný vzorec pozic signálu. Analýza 15N-HSQC umožňuje výzkumníkům vyhodnotit, zda je přítomen očekávaný počet vrcholů, a tedy identifikovat možné problémy v důsledku vícenásobné konformace nebo heterogenity vzorku. Relativně rychlý heteronukleární jediný kvantový korelační experiment pomáhá určit proveditelnost následných delších, dražších a propracovanějších experimentů. Není možné přiřadit vrcholy konkrétním atomům pouze z heteronukleární jediné kvantové korelace.
Aby bylo možné analyzovat data nukleární magnetické rezonance, je důležité získat rezonanční přiřazení proteinu. To znamená zjistit, který chemický posun v každé dimenzi odpovídá kterému atomu. K dosažení tohoto cíle bylo vynalezeno několik různých typů experimentů. Postup závisí na tom, zda je protein izotopicky označen nebo ne, protože mnoho experimentů přiřazení závisí na uhlíku-13 a dusíku-15.
Porovnání 2D spektra COSY a TOCSY pro aminokyselinu jako je glutamát nebo methionin. TOCSY ukazuje diagonální přechody mezi všemi protony ve spektru, ale COSY má pouze přechody mezi sousedy.
Homonukleární nukleární magnetická rezonance
U neoznačeného proteinu je obvyklým postupem zaznamenání souboru dvourozměrných experimentů s homonukleární magnetickou rezonancí pomocí korelační spektroskopie (COSY), z nichž několik typů zahrnuje konvenční korelační spektroskopii, totální korelační spektroskopii (TOCSY) a jadernou Overhauserovu efektovou spektroskopii (NOESY). Dvojrozměrný experiment s nukleární magnetickou rezonancí vytváří dvojrozměrné spektrum. Jednotkou obou os je chemický posun. Útulná a toksová přenosová magnetizace přes chemické vazby mezi sousedními protony. Konvenční experiment s korelační spektroskopií je schopen přenést magnetizaci pouze mezi protony na sousedních atomech, zatímco v experimentu s totální korelační spektroskopií jsou protony schopny přenášet magnetizaci, takže je přenášena mezi všechny protony, které jsou spojeny sousedními protony. Tudíž v konvenční korelační spektroskopii alfa proton přenáší magnetizaci na beta protony, beta protony přenášejí na alfa a gama protony, jsou-li přítomny, pak gama proton přenáší na beta a delta protony a proces pokračuje. V celkové korelační spektroskopii jsou alfa a všechny ostatní protony schopny přenášet magnetizaci na beta, gama, delta, epsilon, jsou-li spojeny souvislým řetězcem protonů. Souvislý řetězec protonů je postranním řetězcem jednotlivých aminokyselin. Tudíž tyto dva experimenty jsou použity ke stavbě tzv. spinových systémů, tedy k sestavení seznamu rezonancí chemického posunu peptidového protonu, alfa protonů a všech protonů z postranního řetězce každého rezidua. Které chemické posuny odpovídají kterým jádrům ve spinovém systému je určeno konvenčními korelačními spektroskopickými spojitostmi a skutečností, že různé typy protonů mají charakteristické chemické posuny. Pro propojení různých spinových systémů v pořadí po sobě jdoucím musí být použit jaderný experiment s Overhauserovou efektovou spektroskopií. Protože tento experiment přenáší magnetizaci prostorem, ukáže křížové špičky všem protonům, které jsou blízko v prostoru bez ohledu na to, zda jsou ve stejném spinovém systému nebo ne. Sousední zbytky jsou neodmyslitelně blízko v prostoru, takže přiřazení mohou provádět špičky v NOESY s jinými spinovými systémy.
Jedním z důležitých problémů při použití homonukleární nukleární magnetické rezonance je překryv mezi vrcholy. To znamená, že různé protony mají stejné nebo velmi podobné chemické posuny. Tento problém se zvětšuje s tím, jak se protein zvětšuje, takže homonukleární magnetická rezonance je obvykle omezena na malé proteiny nebo peptidy.
Dusík-15 nukleární magnetická rezonance
Schéma HNCA a HNCOCA pro čtyři sekvenční zbytky. Dimenze dusíku-15 je kolmá na obrazovku. Každé okno je zaměřeno na chemický posun dusíku této aminokyseliny. Sekvenční přiřazení se provádí porovnáním alfa uhlíkatých chemických posunů. V HNCA každý zbytek vidí alfa uhlík sebe a předchozí zbytek. HNCOCA vidí pouze alfa uhlík předchozího zbytku.
Proces rezonančního přiřazení vzorku značeného dusíkem-15 je podobný homonukleárnímu případu. Nelze provést žádný experiment, který by přenášel magnetizaci mezi dvěma spinovými systémy prostřednictvím vazeb. Hlavním rozdílem je schopnost zaznamenat upravené trojrozměrné experimenty dusíku-15: TOCSY-N HSQC a NOESY-N-HSQC. Tyto experimenty navazují na experiment HSQC, ale mají další protonovou dimenzi. Lze si ji představit tak, že každý vrchol v HSQC má na sobě naskládány vrcholy TOCSY nebo NOESY. Pokud tedy má vrchol TOCSY z amidového protonu, HN, křížový vrchol se svým alfa protonem, Halfou, na souřadnicích (HN, Halpha) v TOCSY spektru, odpovídající vrchol by byl na (HN, Halpha,N) v TOCSY-N-HSQC. Je tedy možné vyřešit překrytí v protonové dimenzi, pokud mají odpovídající dusíky navzájem odlišné chemické posuny.
Uhlík-13 a dusík-15 nukleární magnetická rezonance
Když je bílkovina označena uhlíkem-13 a dusíkem-15, je možné zaznamenat experiment, který přenáší magnetizaci přes peptidovou vazbu, a tak propojit různé spinové systémy přes vazby. To se obvykle provádí pomocí některého z následujících experimentů, HNCO, HNCACO, HNCA, HNCOCA, HNCACB a CBCACONH. Všech šest experimentů se skládá z HSQC roviny rozšířené o uhlíkový rozměr. V HNCO spektrum obsahuje píky při chemických posunech karbonylových uhlíků ve zbytku HSQC píku a předchozí v pořadí. HNCACO obsahuje pouze ten z předchozího rezidua, a je tedy možné přiřadit karbonylové uhlíkové posuny, které odpovídají každému HSQC píku a tomu předchozímu. Je tedy možné přiřadit přiřazení porovnáním posunů vlastních a předchozích uhlíků každého spinového systému. HNCA a HNCOCA fungují podobně, jen s alfa uhlíky spíše než s karbonyly, a HNCACB a CBCACONH obsahují jak alfa uhlík, tak beta uhlík. Obvykle je zapotřebí několik těchto experimentů, aby se vyřešil překryv v uhlíkovém rozměru. Tento postup je obvykle méně nejednoznačný než metoda založená na noesy, protože je založen na přenosu přes vazbu. V metodách založených na NOESY se dodatečné píky, které jsou blízko v prostoru, ale nepatří k sekvenčním reziduím, budou jevit jako matoucí přiřazovací proces. Když bylo provedeno sekvenční přiřazení, je obvykle možné přiřadit postranní řetězce pomocí HCCH-TOCSY, což je v podstatě TOCSY experiment vyřešený v dalším uhlíkovém rozměru.
Aby bylo možné provést konstrukční výpočty, musí být vytvořena řada experimentálně stanovených zádržných zařízení. Ta spadají do různých kategorií, nejrozšířenější jsou zádržné systémy na vzdálenost a úhlové zádržné systémy.
Křížový vrchol v experimentu NOESY značí prostorovou blízkost mezi oběma dotyčnými jádry. Každý vrchol tak může být převeden na maximální vzdálenost mezi jádry, obvykle mezi 1,8 a 6 angstromy. Intenzita vrcholu noesy je úměrná vzdálenosti na minus 6. mocninu, vzdálenost se tedy určuje podle intenzity vrcholu. Vztah intenzity a vzdálenosti není přesný, proto se obvykle používá rozsah vzdáleností.
Je velmi důležité přiřadit špičky noesy správným jádrům na základě chemických posunů. Pokud se tento úkol provádí ručně, je to obvykle velmi náročné na práci, protože proteiny mají obvykle tisíce špiček noesy. Některé počítačové programy jako CYANA provádějí tento úkol automaticky, ve spojení s výpočtem struktury.
Abychom získali co nejpřesnější zadání, je velkou výhodou mít přístup k experimentům s uhlíkem-13 a dusíkem-15, protože pomáhají vyřešit překrývání v protonové dimenzi. To vede k rychlejšímu a spolehlivějšímu zadání a potažmo k lepším strukturám.
Kromě distančních zábran lze vygenerovat zábrany na torzní úhly chemických vazeb, typicky psi a phi úhly. Jedním z přístupů je použití Karplus rovnice, pro vygenerování úhlových zábran ze spojovacích konstant. Jiný přístup používá chemické posuny pro vygenerování úhlových zábran. Obě metody používají fakt, že geometrie kolem alfa uhlíku ovlivňuje spojovací konstanty a chemické posuny, takže vzhledem ke spojovacím konstantám nebo chemickým posunům lze kvalifikovaně odhadnout torzní úhly.
Analytické molekuly ve vzorku mohou být částečně uspořádány s ohledem na vnější magnetické pole spektrometru manipulací s podmínkami vzorku. Běžné techniky zahrnují přidání bakteriofágů nebo bicel do vzorku nebo přípravu vzorku v nataženém polyakrylamidovém gelu. To vytváří lokální prostředí, které zvýhodňuje určité orientace nesférických molekul. Normálně v roztoku NMR se dipolární vazba mezi jádry zprůměruje kvůli rychlému převalování molekuly. Mírná přemnožená jedna orientace znamená, že zůstává pozorována zbytková dipolární vazba. Dipolární vazba se běžně používá v pevném stavu NMR a poskytuje informace o relativní orientaci vazebných vektorů vzhledem k jedinému globálnímu referenčnímu rámci. Obvykle se orientace vektoru N-H zkoumá v HSQC podobném experimentu. Zpočátku se používaly zbytkové dipolární vazby pro zpřesnění dříve stanovených struktur, ale byly provedeny i pokusy o de novo stanovení struktury.
Určení struktury nukleární magnetické rezonance generuje soubor struktur. Struktury se budou sbíhat pouze v případě, že data jsou dostatečná k tomu, aby nadiktovala určitý záhyb. V těchto strukturách to platí pouze pro část struktury. Z PDB 1SSU.
Hydrogen-Deuterium
NMR spektroskopie je specifická pro jádra. Proto může rozlišovat mezi vodíkem a deuteriem. Amidiové protony v proteinu si snadno vyměňují s rozpouštědlem, a pokud rozpouštědlo obsahuje jiný izotop, typicky deuterium, reakce může být sledována NMR spektroskopií. Jak rychle daná amidová výměna odráží, jak je vystavena rozpouštědlu. Amidiové výměnné kurzy tak mohou poskytnout informace o tom, které části proteinu jsou zakopány, navázány vodíkem atd. Běžná aplikace je porovnávání výměny volné formy proti komplexu. Amidy, které se stanou chráněny v komplexu, se předpokládají v interakčním rozhraní.
Experimentálně stanovená omezení mohou být použita jako vstup pro proces výpočtu struktury. Výzkumníci se pomocí počítačových programů, jako je CYANA nebo XPLOR-NIH, snaží uspokojit co nejvíce omezení, kromě obecných vlastností proteinů, jako jsou délky vazeb a úhly. Algoritmy převádějí omezení a obecné vlastnosti proteinů do energetických pojmů, a tak se snaží minimalizovat energii. Výsledkem procesu je soubor struktur, které, pokud by data byla dostatečná k diktování určitého záhybu, se budou sbíhat.
Kromě struktur může nukleární magnetická rezonance poskytovat informace o dynamice různých částí bílkoviny. To obvykle zahrnuje měření relaxačních časů, jako jsou T1 a T2, pro stanovení pořadových parametrů, korelačních časů a chemických výměnných kurzů. Uvolnění NMR je důsledkem lokálních kolísajících magnetických polí uvnitř molekuly. Lokální kolísající magnetická pole jsou generována molekulárními pohyby. Tímto způsobem může měření relaxačních časů poskytovat informace o pohybech uvnitř molekuly na atomární úrovni. Ve studiích dynamiky bílkovin NMR je preferovaným jádrem ke studiu izotop dusíku-15, protože jeho relaxační časy jsou relativně jednoduché na to, aby se vztahovaly k molekulárním pohybům, což však vyžaduje izotopové značení bílkoviny. Relační časy T1 a T2 mohou být měřeny pomocí různých typů experimentů založených na HSQC. Typy pohybů, které lze detekovat, jsou pohyby, které se vyskytují v časovém rozmezí od asi 10 pikosekund do asi 10 nanosekund. Kromě toho lze studovat i pomalejší pohyby, které se odehrávají v časovém rozmezí od asi 10 mikrosekund do 100 milisekund. Protože se však atomy dusíku vyskytují především v páteři proteinu, odrážejí výsledky především pohyby páteřní kosti, která je nejpevnější částí proteinové molekuly. Výsledky získané z měření relaxace dusíku-15 tedy nemusí být reprezentativní pro celý protein. Proto byly v poslední době vyvinuty techniky využívající relaxační měření uhlíku-13 a deuteria, které umožňují systematické studium pohybů vedlejších řetězců aminokyselin v proteinech.
NMR spektroskopie na velkých proteinech
Tradičně nukleární magnetická rezonanční spektroskopie byla omezena na relativně malé proteiny nebo proteinové domény. Částečně je to způsobeno problémy při řešení překrývajících se vrcholů u větších proteinů, ale to bylo zmírněno zavedením značení izotopů a vícerozměrnými experimenty. Dalším závažnějším problémem je skutečnost, že u velkých proteinů se magnetizace uvolňuje rychleji, což znamená, že je méně času na detekci signálu. To následně způsobuje, že se vrcholy stávají širšími a slabšími a nakonec zmizí. Byly zavedeny dvě techniky pro zmírnění uvolnění: příčná relaxačně optimalizovaná spektroskopie (TROSY) a deuterizace proteinů. Použitím těchto technik bylo možné studovat proteiny v komplexu s 900 kDa chaperonem GroES-GroEL .
Automatizace procesu
Stanovení struktury pomocí NMR je tradičně časově náročný proces, který vyžaduje interaktivní analýzu dat vyškoleným vědcem. Existuje značný zájem o automatizaci procesu, aby se zvýšila propustnost stanovení struktury (Viz strukturální genomika). Dva časově nejnáročnější procesy jsou rezonanční přiřazení a přiřazení NOE. Bylo publikováno několik různých počítačových programů, které tyto procesy dělají automaticky . Bylo také vynaloženo úsilí standardizovat protokol výpočtu struktury, aby byl rychlejší a přístupnější automatizaci.