Vývoj vakcíny proti ptačí chřipce technikami reverzní genetiky. Zdvořilost: Národní ústav pro alergie a infekční nemoci
Reverzní genetika je přístup k odhalení funkce genu analýzou fenotypových účinků specifických genových sekvencí získaných sekvenováním DNA. Tento vyšetřovací proces postupuje opačným směrem než takzvané předsunuté genetické screeny klasické genetiky. Jednoduše řečeno, zatímco předsunutá genetika se snaží najít genetický základ fenotypu nebo znaku, reverzní genetika se snaží najít, jaké fenotypy vznikají v důsledku konkrétních genů.
Automatizované sekvenování DNA generuje poměrně rychle velké objemy dat o sekvencích genomu. Mnoho genetických sekvencí je objeveno s předstihem před jinou, méně snadno získatelnou biologickou informací. Reverzní genetika se pokouší spojit danou genetickou sekvenci se specifickými účinky na organismus.
Techniky používané v reverzní genetice
Aby se vědci dozvěděli, jaký vliv má sekvence na fenotyp, nebo aby zjistili její biologickou funkci, mohou provést změnu nebo narušení DNA. Po provedení této změny může výzkumník hledat vliv takových změn na celý organismus. Existuje několik různých metod reverzní genetiky, které se ukázaly jako užitečné:
Přímé delece a bodové mutace
Site-režie mutageneze je sofistikovaná technika, která může buď změnit regulační oblasti v promotoru genu, nebo provést jemné změny kodonu v otevřeném čtení rámu identifikovat důležité amino zbytky pro funkci bílkovin.
Alternativně lze tuto techniku použít k vytvoření null alel, takže gen není funkční. Například u některých organismů, jako jsou kvasinky, myši a mech, lze provést delece genu cílením genu (genové knockout). Unikátní mezi rostlinami, u patens Physcomitrella, je genové knockout pomocí homologní rekombinace
k vytvoření knockout mechu téměř stejně účinný jako u kvasinek. V případě systému modelu kvasinek byly řízené delece vytvořeny v každém genu v genomu kvasinek, který není esenciální. V případě systému modelů rostlin byly vytvořeny obrovské mutantní knihovny založené na konstruktech genové disrupce. V genovém knock-inu je endogenní exon nahrazen změněnou sledem zájmu.
V některých případech lze kondicionální alely použít tak, aby gen měl normální funkci až do aktivace kondicionální alely. To může znamenat „zaklepání“ rekombinantních míst (jako jsou loxová nebo frt místa), které způsobí deleci sledovaného genu při indukci specifické rekombiázy (jako je CRE, FLP). Rekombinázy Cre nebo Flp mohou být indukovány chemickými ošetřeními, ošetřením tepelným šokem nebo mohou být omezeny na specifickou podskupinu tkání.
Další technikou, kterou lze použít, je TILLING. Jedná se o metodu, která kombinuje standardní a účinnou techniku mutageneze s chemickým mutagenem, jako je ethylmethansulfonát (EMS), s citlivou technikou DNA-screeningu, která identifikuje bodové mutace v cílovém genu.
Objev genového umlčování pomocí dvouvláknové RNA, také známé jako RNA interference (RNAi), a vývoj genového knockdownu pomocí Morpholino oligos, učinily narušení genové exprese dostupnou technikou pro mnoho dalších výzkumníků. Tato metoda je často označována jako genový knockdown, protože účinky těchto reagencií jsou obecně dočasné, na rozdíl od genových knockoutů, které jsou trvalé.
RNAi vytváří specifický knockout efekt, aniž by ve skutečnosti mutovala sledovanou DNA. V C. elegans byla RNAi použita k systematickému zásahu do exprese většiny genů v genomu. RNAi působí tak, že řídí buněčné systémy, aby degradovaly cílovou messenger RNA (mRNA).
Zatímco interference RNA spoléhá na účinnost buněčných složek (např. proteiny Dicer, komplex RISC), jednoduchou alternativou pro genový knockdown jsou morfolinové antisense oligos. Morfolina vážou a blokují přístup k cílové mRNA, aniž by vyžadovala aktivitu buněčných proteinů a aniž by nutně urychlovala degradaci mRNA. Morfolina jsou účinná v systémech od bezbuněčného překladu ve zkumavce až po studie in vivo na velkých zvířecích modelech.
Interference při použití transgenů
Molekulárně genetický přístup je tvorba transgenních organismů, které nadměrně exprimují normální sledovaný gen. Výsledný fenotyp může odrážet normální funkci genu.
Alternativně je možné nadměrně exprimovat mutantní formy genu, které interferují s funkcí normálního (wildtype) genu. Například nadměrná exprese mutantního genu může vést k vysokým hladinám nefunkčního proteinu, což vede k dominantní negativní interakci s wildtype proteinem. V tomto případě mutantní verze bude soupeřit o partnery wildtype proteinů, což vede k mutantnímu fenotypu.
Jiné mutantní formy mohou mít za následek bílkovinu, která je abnormálně regulovaná a konstitučně aktivní („zapnutá“ po celou dobu). To může být způsobeno odstraněním regulační domény nebo mutací specifického amino zbytku, který je reverzibilně modifikován (fosforylací, metylací nebo ubiquitinací). Obě změny jsou kritické pro modulaci funkce bílkovin a často vedou k informativním fenotypům.