Timeless (tim) je gen v Drosophile, který kóduje TIM, základní protein, který reguluje cirkadiánní rytmy. Timeless mRNA a protein oscilují rytmicky s časem jako součást transkripční-translační [negativní zpětná vazba] smyčky zahrnující dobový gen a jeho protein.
Timeless byl objeven Dr. Michaelem W. Youngem a jeho kolegy v roce 1994. Tento gen byl nalezen, když si všimli arytmického tim01 mutanta přes hybridní dysgenezi obrazovku.
Funkce v cirkadiánních hodinách
Nadčasový gen je základní složkou molekulárních cirkadiánních hodin v Drosophile. Působí jako součást autoregulační zpětnovazební smyčky ve spojení s produktem genu periody (per). Jeho cirkadiánní vlastnosti byly zaznamenány ve studiích provedených laboratoří doktora Michaela Rosbashe a laboratoří doktora Charlese Weitze. Obě indikovaly, že nadčasový protein (TIM) a dobový protein (PER) tvoří heterodimer, který vykazuje cirkadiánní rytmy u divokého typu Drosophila. Výzkumníci v Rosbashově laboratoři také ukázali, že hladiny tim mRNA a TIM proteinu mají cirkadiánní rytmy, které jsou podobné rytmům periody (per) a jeho produktu.
PER/TIM heterodimer reguluje transkripci genů periody (per) a nadčasovosti (tim). Nejprve se PER/TIM heterodimery vytvoří v cytoplazmě, akumulují se a poté translokují do jádra. Komplex pak blokuje hodiny a cyklus pozitivního transkripčního faktoru (CLK) a cyklu (CYC).
Jako součást cirkadiánních hodin je nadčasovost nezbytná pro zachycení do světlo-tmavých (LD) cyklů. Typická délka periody volně běžící Drosophily je 23,9 hodiny, což vyžaduje adaptaci na 24hodinový environmentální cyklus. Adaptace začíná nejprve expozicí světlu. Tento proces vede k rychlé degradaci TIM proteinu, umožňující organismům za úsvitu vstoupit do environmentálních cyklů. V cyklech světlo-tma se hladina TIM proteinu rychle snižuje v pozdních nočních/časných ranních hodinách, následovaná podobnými, ale pozvolnějšími změnami v hladině PER proteinu. Degradace TIM je nezávislá na per a jeho proteinu a uvolňuje PER z komplexu PER/TIM. Tím končí PER/TIM represe CLK/CYC-zprostředkované transkripce genů per a tim, což umožňuje produkovat per a tim mRNA pro restart cyklu. V některých typech buněk se fotoreceptorový protein kryptochrom (CRY) fyzicky spojuje s TIM a pomáhá regulovat degradaci závislou na světle. CRY je aktivován modrým světlem, které se váže na TIM a značkuje ji pro degradaci.
Tento mechanismus umožňuje zachycení much do okolních světelných podnětů. Když Drosophila přijímá světelné vstupy v časné subjektivní noci, degradace TIM vyvolaná světlem způsobí zpoždění akumulace TIM, což vytváří fázové zpoždění. Když jsou světelné vstupy přijímány v pozdní subjektivní noci, světelný puls způsobí degradaci TIM dříve než za normálních podmínek, což vede k fázovému postupu.
U Drosophily jsou negativní faktory PER/TIM, stejně jako pozitivní faktory CLK/CYC, nakonec degradovány kaseinkinázou zprostředkovaným fosforylačním cyklem, což umožňuje kolísání genové exprese podle podnětů prostředí. Tyto proteiny zprostředkovávají oscilační expresi transkripčního faktoru VRILLE (VRI), který je nutný pro behaviorální rytmičnost, per a timovou expresi a akumulaci PDF (pigment-dispersing factor).
Nadčasový v kriketu Gryllus bimaculatus
Timeless se nezdá být zásadní pro oscilaci cirkadiánních hodin u všech druhů hmyzu. U volně žijících cvrčků vykazuje tim mRNA rytmickou expresi v LD i DD (tmavě-tmavé cykly) podobnou jako u per, vrcholící během (subjektivní) noci. Při injekci tim dvouvláknové RNA (dstim) byly hladiny tim mRNA významně sníženy a jeho cirkadiánní expresní rytmus byl eliminován. Po ošetření dstim však dospělí cvrčci vykazovali jasný pohybový rytmus v konstantní tmě, s periodou volného běhu výrazně kratší než u kontrolních cvrčků, kterým byl aplikován Discosoma sp. Red2 (DsRed2) dsRNA. Tyto výsledky naznačují, že v cvrčkovi hraje tim určitou roli při dolaďování periody volného běhu, ale nemusí být zásadní pro oscilaci cirkadiánních hodin.
Savčí homology pro nadčasové
V roce 1998 vědci identifikovali myšího homologa a lidského homologa nadčasového genu Drosophila. Přesná role TIM u savců je stále nejasná, protože transkripce Tim rytmicky nekolísá a protein TIM zůstává v jádru. Navíc je savčí tim ortologičtější než Tim-2 (Timeout) paralog genu Drosophila Timeless. Funkce Timeoutu zatím nebyla identifikována.
Má se za to, že nadčasový protein přímo spojuje buněčný cyklus s cirkadiánním rytmem u savců. V tomto modelu zvaném „přímé spojení“ oba cykly sdílejí klíčový protein, jehož exprese vykazuje cirkadiánní vzor.
Nedávné práce na savčím nadčasovosti (mTim) u myší naznačily, že identifikované geny nemusí hrát u savců stejnou zásadní roli jako u Drosophily jako základní funkce cirkadiánních hodin. mTim je vyjádřen v suprachiasmatickém jádru (SCN), ale v konstantních podmínkách nedochází k oscilaci jeho doprovodné RNA nebo proteinových produktů. Hladiny TIM proteinu u savců se nemění se světelnými signály, ale je hlášena interakce se savčím dobovým proteinem PER1 a savčím kryptochromem (CRY1 a CRY2). Je prokázáno, že mTim je nezbytný pro embryonální vývoj u myší, což naznačuje odlišnou funkci genu než u Drosophily To naznačuje odlišnost mezi savčími hodinami a Drosophilovými hodinami.
Bylo prokázáno, že lidský nadčasový protein (hTIM) je potřebný pro tvorbu elektrického oscilačního výstupu suprachiasmatickým jádrem (SCN), hlavními hodinami řídícími všechny tkáňově specifické cirkadiánní rytmy těla. Tento protein také interaguje s produkty hlavních hodinových genů CLOCK, BMAL, PER1, PER2 a PER3.