Optogenetika

Optogenetika (z řeckého optos, což znamená „viditelný“) je neuromodulační technika používaná v neurovědě, která využívá kombinaci technik z optiky a genetiky ke kontrole a sledování činnosti jednotlivých neuronů v živé tkáni – a to i uvnitř volně se pohybujících zvířat – a k přesnému měření účinků těchto manipulací v reálném čase. Klíčovými činidly používanými v optogenetice jsou bílkoviny citlivé na světlo. Prostorově přesného ovládání neuronů se dosahuje pomocí optogenetických aktuátorů, jako je channelrhodopsin, halorhodopsin a archaerhodopsin, zatímco časově přesné záznamy lze pořídit pomocí optogenetických senzorů, jako je Clomeleon, Mermaid a SuperClomeleon.

Nejstarší přístupy byly vyvinuty a aplikovány v laboratoři Gera Miesenböcka, nyní Waynfleteho profesora fyziologie na Oxfordské univerzitě, a Richarda Kramera a Ehuda Isacoffa na Kalifornské univerzitě v Berkeley; tyto metody propůjčovaly citlivost na světlo, ale nikdy nebyly považovány za užitečné jinými laboratořemi kvůli mnoha složkám, které tyto přístupy vyžadovaly. Odlišný jednosložkový přístup zahrnující mikrobiální opsinové geny zavedený v roce 2005 se ukázal být široce aplikovaný, jak je popsáno níže. Optogenetika je známá vysokým prostorovým a časovým rozlišením, které poskytuje při změně aktivity specifických typů neuronů v rámci definovaných oblastí mozku za účelem kontroly chování subjektu.

V roce 2010 byl Karl Deisseroth na Stanfordově univerzitě oceněn inaugurační cenou HFSP Nakasone Award „za průkopnickou práci na vývoji optogenetických metod pro studium funkce neuronálních sítí, které jsou základem chování“.

V roce 2010 byla optogenetika zvolena jako Metoda roku napříč všemi obory vědy a inženýrství interdisciplinárním výzkumným časopisem Nature Methods (Primer on Optogenetics, Editorial
Commentary). Současně byla optogenetika zdůrazněna v článku „Průlomy desetiletí“ ve vědeckém výzkumném časopise Science tyto časopisy také odkazovaly na nedávné veřejně přístupné video Metoda roku a textové SciAm shrnutí optogenetiky.

V roce 2012 byl Gero Miesenböck oceněn InBev-Baillet Latour International Health Prize za „průkopnické optogenetické přístupy k manipulaci s aktivitou neuronů a ke kontrole chování zvířat“.

V roce 2013 obdrželi Ernst Bamberg, Ed Boyden, Karl Deisseroth, Peter Hegemann, Gero Miesenböck a Georg Nagel cenu The Brain Prize za „jejich vynález a zdokonalení optogenetiky“.

„Za vlasy přitaženou“ možnost využití světla pro selektivní kontrolu přesných vzorců nervové aktivity (akčního potenciálu) v rámci podtypů buněk v mozku formuloval Francis Crick ve svých Kufflerových přednáškách na Kalifornské univerzitě v San Diegu v roce 1999. Rané využití světla k aktivaci neuronů provedli Richard Fork a později Rafael Yuste, kteří prokázali laserovou aktivaci neuronů uvnitř neporušené tkáně, i když ne geneticky cíleným způsobem. O nejstarší geneticky cílené metodě, která používala světlo k ovládání geneticky citlivých neuronů, informovali v lednu 2002 Boris Zemelman (nyní na UT Austin) a Gero Miesenböck, kteří používali fotoreceptory Drosophila rhodopsin k ovládání nervové aktivity v kultivovaných savčích neuronech. V roce 2003 Zemelman a Miesenböck vyvinuli druhou metodu pro na světle závislou aktivaci neuronů, ve které byly jednotlivé ionotropní kanály TRPV1, TRPM8 a P2X2 řízeny ligandy v klecích v reakci na světlo. Počínaje rokem 2004 vyvíjely skupiny Kramer a Isacoff organické fotospínače neboli „uzavřené“ sloučeniny, které mohly interagovat s geneticky zavedenými iontovými kanály. Tyto dřívější přístupy však nebyly mimo původní laboratoře používány, pravděpodobně kvůli technickým problémům při dodávání požadovaných vícesložkových částí.

Doporučujeme:  Soupis hodnocení osobnosti

V dubnu 2005 ohlásily Susana Lima a Miesenböck první použití geneticky cílené fotostimulace P2X2 ke kontrole chování zvířete. Ukázaly, že fotostimulace geneticky ohraničených skupin neuronů, například dopaminergního systému, vyvolala u octomilek charakteristické změny chování. V srpnu 2005 laboratoř Karla Deisserotha na katedře bioinženýrství ve Stanfordu zahrnující postgraduální studenty Eda Boydena a Fenga Zhanga (oba nyní na MIT) zveřejnila první ukázku jednosložkového optogenetického systému, počínaje kultivovanými savčími neurony. za použití channelrhodopsinu, jednosložkového světlem aktivovaného kationtového kanálu z jednobuněčných řas), jehož molekulární identita a hlavní vlastnosti, které jej činí užitečným pro optogenetické studie, byly poprvé popsány v listopadu 2003 skupinou Georga Nagela. Skupiny Gottschalka a Nagela byly první, které rozšířily použitelnost Channelrhodopsinu-2 pro kontrolu neuronální aktivity na neporušené zvíře tím, že ukázaly, že motorické vzory u oblých červů Caenorhabditis elegans mohou být vyvolány cílenou expresí a stimulací Channelrhodopsinu-2 ve vybraných nervových obvodech (publikováno v prosinci 2005).

Obr. 1. Channelrhodopsin-2 (ChR2) indukuje časově přesnou aktivitu řízenou modrým světlem u prelimbických prefrontálních kortikálních neuronů potkanů. a) Schéma in vitro (vlevo) zobrazující podání modrého světla a celobuněčný záznam aktivity vyvolané světlem ze zářivky CaMKllα::ChR2-EYFP exprimující pyramidový neuron (vpravo) v akutním řezu mozku. b) Schéma in vivo (vlevo) zobrazující podání modrého světla (473 nm) a záznam jedné jednotky. (vlevo dole) Koronální řez mozku zobrazující výraz CaMKllα::ChR2-EYFP v prelimbické oblasti. Světle modrá šipka zobrazuje špičku optického vlákna; černá šipka zobrazuje špičku záznamové elektrody (vlevo). Bílý pruh, 100 µm. (vpravo dole) Záznam světla in vivo prefrontálního kortikálního neuronu v transdukovaném CaMKllα::ChR2-EYFP potkan zobrazující světelně evokované vystřelení modrých světelných pulsů na 20 Hz (vpravo). Vložená, reprezentativní odezva jedné jednotky vyvolaná světlem.

Obr 2. Halorhodopsin (NpHR) rychle a reverzibilně umlčuje spontánní aktivitu in vivo v prelimbické prefrontální kůře potkanů. (Vlevo nahoře) Schéma znázorňující in vivo zelený (532 nm) světelný projev a jednojednotkový záznam spontánně aktivního CaMKllα::eNpHR3.0- EYFP exprimujícího pyramidový neuron. (Vpravo) Příkladová stopa znázorňující, že kontinuální 532 nm osvětlení inhibuje jednojednotkovou aktivitu in vivo. Vložená, reprezentativní jednojednotková událost; zelený pruh, 10 sekund.

Hlístice exprimující iontový kanál Mac citlivý na světlo. Mac je protonová pumpa původně izolovaná v houbě Leptosphaeria maculans a nyní exprimovaná ve svalových buňkách C. elegans, která se otevírá v reakci na zelené světlo a způsobuje hyperpolarzující inhibici. Za zmínku stojí prodloužení délky těla, kterým červ prochází pokaždé, když je vystaven zelenému světlu, což je pravděpodobně způsobeno Macovými svalovými relaxačními účinky.

Doporučujeme:  Else Frenkel-Brunswik

Hlístice exprimující ChR2 ve své gubernakulárně-šikmé svalové skupině reagující na stimulaci modrým světlem. Stimulace modrým světlem způsobuje, že gubernakulárně-šikmé svaly se opakovaně stahují, což způsobuje opakované výpady spicule, jak by bylo přirozeně vidět při kopulaci.

Časová přesnost v řádu milisekund je pro optogenetiku stěžejní, což experimentátorovi umožňuje držet krok s rychlým biologickým zpracováním informací (například při zkoumání kauzální role specifických vzorců akčního potenciálu v definovaných neuronech). Pro sondování nervového kódu musí optogenetika podle definice pracovat v milisekundovém časovém měřítku, aby umožnila přidání nebo smazání přesných vzorců aktivity v rámci specifických buněk v mozcích neporušených zvířat, včetně savců (viz obrázek 1). Pro srovnání, časová přesnost tradičních genetických manipulací (používaných pro sondování kauzální role specifických genů v buňkách, prostřednictvím „ztráty funkce“ nebo „zisku funkce“ změn v těchto genech) je dosti pomalá, od hodin nebo dnů až měsíců. V optogenetice je důležité mít také rychlé odečty, které dokážou držet krok s optickou kontrolou. To může být provedeno pomocí elektrických záznamů („optrody“) nebo pomocí reporterských proteinů, které jsou biosenzory, kde vědci spojili fluorescenční proteiny na detekční proteiny. Příkladem toho je fluorescenční protein citlivý na napětí (VSFP2).

Charakteristickým znakem optogenetiky je proto zavedení rychlých světlem aktivovaných kanálů a enzymů, které umožňují časově přesnou manipulaci s elektrickými a biochemickými ději při zachování rozlišení buněčného typu pomocí specifických zaměřovacích mechanismů. Mezi mikrobiální opsiny, které mohou být použity k vyšetření funkce nervových systémů, patří channelrhodopsiny (ChR2, ChR1, VChR1 a SFO) k excitaci neuronů. Pro tlumení byly použity halorhodopsiny (NpHR), rozšířené halorhodopsiny (eNpHR2.0 a eNpHR3.0), archaerhodopsin (Arch), Leptosphaeria maculans fungal opsins (Mac) a rozšířené bakteriorhodopsiny (eBR) k inhibici neuronů (viz obrázek 2), a to i u volně se pohybujících savců.

Kromě toho je nyní možná i optogenetická kontrola přesně definovaných biochemických dějů v rámci chování savců. Na základě předchozí práce spojující obratlovce s opsiny specifických receptorů spřažených s G-proteinem byla vytvořena rodina chimérických jednosložkových optogenetických nástrojů, které umožnily výzkumníkům manipulovat v rámci chování savců s koncentrací definovaných intracelulárních poslů, jako jsou cAMP a IP3 v cílených buňkách Brzy poté následovaly další biochemické přístupy k optogenetice (hlavně s nástroji, které vykazovaly nízkou aktivitu ve tmě), kdy bylo dosaženo optické kontroly nad malými GTPázami a adenylyl cyklázami v kultivovaných buňkách pomocí nových strategií z několika různých laboratoří. Tento nově vznikající repertoár optogenetických sond nyní umožňuje specifickou pro buněčný typ a časově přesnou kontrolu více os buněčné funkce v rámci neporušených zvířat.

Ke stimulaci povrchových mozkových oblastí, jako je mozková kůra, mohou být optická vlákna nebo LED přímo připevněny k lebce zvířete. Hlubší implantovaná optická vlákna byla použita k dodání světla do hlubších mozkových oblastí. Jako doplněk k vlákny připoutaným přístupům byly vyvinuty zcela bezdrátové techniky využívající bezdrátově dodávanou energii do čelních LED pro nerušené studium komplexního chování u volně se chovajících obratlovců. U bezobratlých, jako jsou červi a octomilky, je určité množství retinální izomerázy all-trans-retinal (ATR) doplněno potravou. Klíčovou výhodou mikrobiálních opsinů, jak je uvedeno výše, je, že jsou plně funkční bez přidání exogenních kofaktorů u obratlovců.

Doporučujeme:  Samostatné řízení pracovních týmů

Oblast optogenetiky podpořila základní vědecké pochopení toho, jak konkrétní typy buněk přispívají k funkci biologických tkání, jako jsou nervové obvody in vivo (viz odkazy z vědecké literatury níže). Po klinické stránce navíc optogenetikou řízený výzkum vedl k poznatkům o Parkinsonově nemoci a dalších neurologických a psychiatrických poruchách. Optogenní práce v roce 2009 skutečně také poskytly vhled do nervových kódů týkajících se autismu, schizofrenie, zneužívání drog, úzkosti a deprese.

Bylo poukázáno na to, že optogenetika představuje kromě svého vědeckého dopadu také důležitou případovou studii jak v hodnotě ekologické ochrany (protože mnoho klíčových nástrojů optogenetiky pochází z mikrobiálních organismů, které obývají specializované ekologické niky), tak v důležitosti čistě základní vědy (protože tyto opsiny byly po desetiletí zkoumány ve vlastním zájmu biofyziky a mikrobiology, aniž by se uvažovalo o jejich potenciální hodnotě při poskytování poznatků o neurovědě a neuropsychiatrických onemocněních).

V následujících oblastech mozku a typech buněk byla zaznamenána in vivo optogenetická aktivace a/nebo umlčení.

Optogenetické přístupy byly použity k mapování nervových obvodů v amygdale, které přispívají k podmiňování strachu.

Deisserothova laboratoř integrovala optogenetiku, volně se pohybující chování savců, elektrofyziologii in vivo a slice fyziologii, aby prozkoumala cholinergní interneurony nucleus accumbens přímou excitací nebo inhibicí. Přestože tyto cholinergní buňky představují méně než 1% z celkové populace akumbalových neuronů, jsou schopny kontrolovat aktivitu dopaminergních terminálů, které v nucleus accumbens inervují střední spinální neurony (MSN). Je známo, že tyto akumbalové MSN se podílejí na nervové dráze, jejímž prostřednictvím kokain působí, a protože bylo prokázáno, že snižující se kokainem indukované změny v aktivitě těchto neuronů inhibují kondicionování kokainu. Těch několik málo cholinergních neuronů přítomných v nucleus accumbens může být životaschopným cílem farmakoterapie v léčbě závislosti na kokainu.

In vivo a in vitro záznamy (pořízené Cooperovou laboratoří) jednotlivých CAMKII AAV-ChR2 exprimujících pyramidové neurony v prefrontální kůře mozkové prokázaly vysoký výstup akčního potenciálu věrnosti s krátkými pulzy modrého světla při 20 Hz (obrázek 1). Stejná skupina zaznamenala úplné umlčení spontánní aktivity vyvolané zeleným světlem u stejné populace prefrontálních kortikálních neuronů exprimujících vektor AAV-NpHR (obrázek 2).