Mikrosatelity neboli SSR (Simple Sequence Repeats) jsou polymorfní lokusy přítomné v jaderné DNA, které se skládají z opakujících se jednotek o délce 1-4 párů bází. Jsou typicky neutrální, spoludominantní a používají se jako molekulární markery, které mají široké uplatnění v oblasti genetiky, včetně příbuzenských a populačních studií. Mikrosatelity mohou být také použity ke studiu dávkování genů (hledání duplikací nebo delecí konkrétní genetické oblasti).
Jedním z častých příkladů mikrosatelitu je (CA)n repeat, kde n je variabilní mezi alelami. Tyto markery často vykazují vysokou úroveň interspecifického a intraspecifického polymorfismu, zejména pokud tandem opakuje číslo deset nebo více. Opakovaná sekvence je často jednoduchá, skládá se ze dvou, tří nebo čtyř nukleotidů (di-, tri-, a tetranukleotid repeats), a může být zopakována 10 až 100krát. CA nukleotidové repeats jsou velmi časté v lidských i jiných genomech a vyskytují se každých několik tisíc párů bází. Vzhledem k tomu, že v lokusu mikrosatelitu je často přítomno mnoho alel, genotypy v rámci rodokmenů jsou často plně informativní v tom, že lze často identifikovat původce konkrétní alely. Tímto způsobem jsou mikrosatelity ideální pro stanovení otcovství, populačně genetické studie a rekombinační mapování. Jsou také jediným molekulárním markerem, který poskytuje vodítko k tomu, které alely jsou si bližší.
Mikrosatelity vděčí za svou variabilitu zvýšené míře mutace ve srovnání s ostatními neutrálními oblastmi DNA. Tyto vysoké míry mutace lze nejčastěji vysvětlit chybným spárováním (proklouznutím) řetězce během replikace DNA na jedné dvojité šroubovici DNA. Mutace může nastat také během rekombinace během meiózy. Některé chyby ve proklouznutí jsou napraveny korekčními mechanismy v jádře, ale některé mutace mohou uniknout opravě. Velikost jednotky opakování, počet opakování a přítomnost opakování variant jsou všechny faktory, stejně jako frekvence transkripce v oblasti opakování DNA. Přerušení mikrosatelitů, možná kvůli mutaci, může vést ke snížení polymorfismu. Nicméně, stejný mechanismus může občas vést k nesprávné amplifikaci mikrosatelitů; pokud dojde ke proklouznutí brzy během PCR, mohou být mikrosatelity nesprávné délky amplifikovány.
Amplifikace mikrosatelitů
Mikrosatelity mohou být pro identifikaci amplifikovány pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR), pomocí šablon vedlejších oblastí (primerů). DNA je denaturována při vysoké teplotě, odděluje dvojité vlákno, umožňuje žíhání primerů a rozšíření nukleotidových sekvencí podél protilehlých vláken při nižších teplotách. Tento proces vede k produkci dostatečného množství DNA, které je viditelné na agarózových nebo akrylamidových gelech; pro amplifikaci je potřeba jen malé množství DNA, protože termocyklace tímto způsobem vytváří exponenciální nárůst replikovaného segmentu. S hojností PCR technologie jsou primery, které lemují mikrosatelitní lokusy, jednoduché a rychle použitelné, ale vývoj správně fungujících primerů je často zdlouhavý a nákladný proces.
Vývoj mikrosatelitních primerů
Při hledání mikrosatelitních markerů ve specifických oblastech genomu; například v rámci konkrétního exonu genu, mohou být primery navrženy ručně. To zahrnuje hledání sekvence genomické DNA pro opakování mikrosatelitů, které lze provést okem nebo pomocí automatizovaných nástrojů, jako je například masker opakování. Jakmile jsou potenciálně užitečné mikrosatelity určeny (odstranění neužitečných, jako jsou ty s náhodnými vložkami v oblasti opakování), mohou být doprovodné sekvence použity k návrhu oligonukleotidových primerů, které zesílí specifické opakování mikrosatelitů v PCR reakci.
Náhodné mikrosatelitní primery mohou být vyvinuty klonováním náhodných segmentů DNA z fokálních druhů. Ty jsou vloženy do plazmidového nebo fágového vektoru, který je následně implantován do bakterií Escherichia coli. Kolonie jsou pak vyvinuty a screenovány fluorescenčně značenými oligonukleotidovými sekvencemi, které se hybridizují do mikrosatelitního opakování, pokud jsou přítomny na segmentu DNA. Pokud lze tímto postupem získat pozitivní klony, DNA je sekvenována a PCR primery jsou vybrány ze sekvencí lemujících tyto oblasti, aby se určil specifický lokus. Tento proces zahrnuje významné pokusy a chyby na straně výzkumníků, protože mikrosatelitní sekvence opakování musí být předpovězeny a primery, které jsou náhodně izolovány, nemusí vykazovat významný polymorfismus. Mikrosatelitové lokusy jsou široce rozšířeny v celém genomu a mohou být izolovány z polodegradované DNA starších vzorků, protože vše, co je potřeba, je vhodný substrát pro amplifikaci pomocí PCR.
Omezení mikrosatelitů
Mikrosatelity se ukázaly být univerzálními molekulárními markery, zejména pro populační analýzu, ale nejsou bez omezení. Mikrosatelity vyvinuté pro konkrétní druhy lze často aplikovat na blízce příbuzné druhy, ale procento lokusů, které úspěšně amplifikují, se může s rostoucí genetickou vzdáleností snižovat. Bodová mutace v místech žíhání primerů u takových druhů může vést k výskytu „null alel“, kdy se mikrosatelitům nedaří amplifikovat v PCR testech. Null alely lze připsat několika jevům. Sekvenční odlišnost v okrajových oblastech může vést ke špatnému žíhání primerů, zejména v 3’ sekci, kde dochází k extenzi; preferenční amplifikace alel určité velikosti v důsledku kompetitivního charakteru PCR může vést k tomu, že heterozygotní jedinci získají skóre pro homozygozitu (částečný null). K selhání PCR může dojít, když se konkrétní lokusy nezvětší, zatímco jiné se zesilují efektivněji a mohou se jevit homozygotní při gelovém testu, když jsou ve skutečnosti heterozygotní v genomu. Nulové alely komplikují interpretaci frekvencí mikrosatelitních alel a tím vytvářejí odhady chybovosti příbuznosti. Kromě toho mohou stochastické účinky odběru vzorků, ke kterým dochází během páření, měnit frekvence alel způsobem, který je velmi podobný účinku nulových alel; nadměrná frekvence homozygotů způsobující odchylky od Hardyho-Weinbergova rovnovážného očekávání. Jelikož jsou nulové alely technickým problémem a odběrové efekty, ke kterým dochází během páření, jsou skutečnou biologickou vlastností populace, je často velmi důležité mezi nimi rozlišovat, pokud jsou pozorovány nadměrné homozygoty.
Při použití mikrosatelitů ke srovnání druhů může být u příbuzných druhů homologní lokus snadno amplifikován, ale počet lokusů, které úspěšně amplifikují během PCR, může klesat se zvýšenou genetickou vzdáleností mezi danými druhy. Mutace u mikrosatelitních alel je zkreslená v tom smyslu, že větší alely obsahují více bází, a proto je pravděpodobné, že budou špatně přeloženy při replikaci DNA. Menší alely mají také tendenci zvětšovat se, zatímco větší alely mají tendenci zmenšovat se, protože mohou podléhat hornímu velikostnímu limitu; toto omezení bylo stanoveno, ale možné hodnoty ještě nebyly specifikovány. Pokud je velký velikostní rozdíl mezi jednotlivými alelami, může dojít ke zvýšené nestabilitě během rekombinace při meióze. V nádorových buňkách, kde může být kontrola replikace poškozena, mohou být mikrosatelity získány nebo ztraceny se zvláště vysokou frekvencí během každého kola mitózy. Proto může nádorová buněčná linie vykazovat jiný genetický otisk než hostitelská tkáň.