Hodiny (Circadian Locomotor Output Cycles Kaput) je gen kódující základní helix-loop-helix-PAS transkripční faktor (CLOCK), který ovlivňuje perzistenci i periodu cirkadiánních rytmů. CLOCK funguje jako nezbytný aktivátor navazujících prvků v dráze kritické pro generování cirkadiánních rytmů.
Gen Clock byl poprvé identifikován v roce 1994 Dr. Josephem Takahashim a jeho kolegy. Takahashi použil předsunutý screening mutageneze u myší léčených N-ethyl-N-nitrosoureou k vytvoření a identifikaci mutací v klíčových genech, které široce ovlivňují cirkadiánní aktivitu. Mutanty Clock objevené přes obrazovku vykazovaly abnormálně dlouhou dobu denní aktivity. Tato vlastnost se ukázala být dědičná a myši chované jako homozygotní pro mutaci nakonec ztratily po několika dnech v konstantní tmě veškerou cirkadiánní rytmičnost. To ukázalo, že neporušené geny Clock jsou nezbytné pro normální cirkadiánní funkci savců.
Bylo zjištěno, že protein CLOCK hraje ústřední roli jako transkripční faktor v cirkadiánním kardiostimulátoru. V Drosophile je nově syntetizovaný CLOCK (CLK) hypofosforylován v cytoplazmě před vstupem do jádra. Jakmile se CLK dostane do jádra, je lokalizován v nuleárních ložiscích a později je homogenně redistribuován. CYCLE(CYC) (také známý jako dBMAL pro BMAL1 ortholog u savců) dimerizuje s CLK přes jejich příslušné PAS domény. Tento dimer pak získává koaktivátor CREB-vázající protein (CBP) a je dále fosforylován. Po fosforylaci se tento CLK-CYC komplex váže na E-box elementy promotorů periody (per) a nadčasovosti (tim) přes svou bHLH doménu, což způsobuje stimulaci genové exprese per a timu. Velký molární přebytek periody (PER) a nadčasových (TIM) proteinů způsobuje tvorbu PER-TIM heterodimeru, který brání CLK-CYC heterodimeru ve vazbě na E-boxy per a timu, což v podstatě blokuje per a timovou transkripci. CLK je hyperfosforylován, když DBT kináza interaguje s CLK-CYC komplexem v závislosti na PER, destabilizuje CLK i PER, což vede k degradaci obou proteinů.
Hypofosforylovaný CLK se pak hromadí, váže se na E-boxy per a tim a opět aktivuje jejich transkripci. Tento cyklus posttranslační fosforylace naznačuje, že časová fosforylace CLK pomáhá v časovém mechanismu cirkadiánních hodin.
Podobný model je nalezen u myší, u kterých BMAL1 dimerizuje s CLOCK za účelem aktivace per a cryptochrome(cry) transkripce. PER a CRY proteiny tvoří heterodimer, který působí na CLOCK-BMAL heterodimer za účelem potlačení transkripce per a cry.
CLOCK vykazuje aktivitu histonacetyltransferázy (HAT), která je posílena dimerizací s BMAL1. Dr. Paolo Sassone-Corsi a jeho kolegové in vitro prokázali, že aktivita HAT zprostředkovaná CLOCK je nezbytná pro záchranu cirkadiánních rytmů u Clock mutantů.
Clock mutantní organismy mohou mít buď nulovou mutaci, nebo antimorfní alelu na Clockově lokusu, která kóduje antagonistu proteinu divokého typu. Přítomnost antimorfního proteinu snižuje regulaci transkripčních produktů, které Clock normálně reguluje.
U Drosophily mutantní forma Hodiny (Jrk) vzniklá z předčasného stop kodonu, který eliminuje aktivační doménu proteinu CLOCK, způsobuje dominantní účinky: polovina heterozygotních much s tímto mutovaným genem má změněnou periodu, zatímco druhá polovina se stává arytmickou. Homozygotní mouchy jsou všechny arytmické. Navíc tyto mutované mouchy exprimují nízké hladiny proteinů PER a TIM, což naznačuje, že Hodina funguje jako pozitivní prvek v cirkadiánní smyčce.
Myší homolog na Jrk mutant je ClockΔ19 mutant, který má deleci v exonu 19 Clock genu. Tato dominantně negativní mutace má za následek defektní CLOCK-BMAL dimer, který způsobuje, že myši mají sníženou schopnost aktivace per transkripce. V konstantní tmě myši ClockΔ19 heterozygotní pro alelu Clock mutant vykazují prodlouženou cirkadiánní periodu, zatímco myši ClockΔ19/Δ19 homozygotní pro alelu se stávají arytmickými. U heterozygotů i homozygotů tato mutace také produkuje prodlouženou periodu a arytmii na úrovni jedné buňky.
Clock -/- null mutované myši, u kterých byl Clock vyřazen, vykazují zcela normální cirkadiánní rytmy. Objev null Clock mutantu s fenotypem divokého typu přímo zpochybnil široce přijímanou premisu, že Clock je nezbytný pro normální cirkadiánní funkci. Dále naznačil, že dimer CLOCK-BMAL1 nemusí existovat pro modulaci jiných prvků cirkadiánní dráhy. Neuronální PAS doména obsahující protein 2 (NPAS2, analog CLOCK) může u těchto Clock-null myší nahradit CLOCK.
Role hodin v dalších smyčkách zpětné vazby
Dimer CLOCK-BMAL se podílí na regulaci dalších genů a zpětnovazebních smyček. Na komplex CLOCK-BMAL se také váže enzym SIRT1, který potlačuje jeho aktivitu, například deacetylací Bmal1 a okolních histonů. Úloha SIRT1 je však stále kontroverzní a může mít také roli v deacetylaci PER proteinu, cílené na jeho degradaci.
Dimer CLOCK-BMAL působí jako pozitivní končetina zpětnovazební smyčky. Vazba CLOCK-BMAL na promotorový prvek E-boxu aktivuje transkripci hodinových genů, jako jsou per1, 2 a 3 a tim u myší. U myší bylo prokázáno, že CLOCK-BMAL aktivuje také gen Nikotinamid fosforibosyltransferázy (nazývaný také Nampt), který je součástí samostatné zpětnovazební smyčky. Tato zpětnovazební smyčka vytváří metabolický oscilátor. Dimer CLOCK-BMAL aktivuje transkripci genu Nampt, který kóduje protein NAMPT. NAMPT je součástí série enzymatických reakcí, které kryjí niacin (nazývaný také nikotinamid) na NAD. SIRT1, který pro svou enzymatickou aktivitu vyžaduje NAD, pak používá zvýšené hladiny NAD k deacetylaci BMAL1, čímž ji potlačuje. Výsledkem tohoto potlačení je menší transkripce NAMPT, menší množství proteinu NAMPT, menší množství vytvořeného NAD, a tedy menší množství SIRT1 a menší potlačení dimeru CLOCK-BMAL. Tento dimer může opět pozitivně aktivovat transkripci genu Nampt a cyklus pokračuje, čímž se vytváří další oscilační smyčka zahrnující CLOCK-BMAL jako pozitivní prvky. Klíčová role, kterou hodiny hrají v metabolických a cirkadiánních smyčkách, zdůrazňuje úzký vztah mezi metabolismem a cirkadiánními hodinami.
U lidí může polymorfismus v Hodinách, rs6832769, souviset s příjemností osobnostního rysu. Další jednonukleotidový polymorfismus (SNP) v Hodinách, 3111C, je spojován s diurnální preferencí. Tento SNP je také spojován se zvýšenou nespavostí, obtížným hubnutím a opětovným výskytem depresivních epizod u pacientů s bipolární poruchou.
U myší se Clock podílel na poruchách spánku, metabolismu, těhotenství a poruchách nálady. Hodinově zmutované myši spí každý den méně než normální myši. Myši také vykazují změněnou hladinu glukózy v plazmě a rytmus v příjmu potravy. U těchto mutantů se v průběhu času rozvinou příznaky metabolického syndromu. Hodinově zmutované myši dále vykazují narušené estrální cykly a zvýšený počet úplných těhotenských selhání. Mutant Clock je také spojován s příznaky podobnými bipolární poruše u myší, včetně mánie a euforie. Hodinově zmutované myši také vykazují zvýšenou dráždivost dopaminových neuronů v centrech odměny v mozku. Tyto výsledky vedly doktorku Colleen McClungovou k návrhu použít Clock zmutované myši jako model pro poruchy lidské nálady a chování.
Bylo rovněž prokázáno, že dimer CLOCK-BMAL aktivuje alfa receptor reverzního erbu (Rev-ErbA alfa) a alfa receptor pro vzácná onemocnění retinové kyseliny (ROR-alfa). REV-ERBα a RORα regulují Bmal vazbou na prvky odezvy pro vzácná onemocnění související s retinovou kyselinou (ROREs) v jeho promotoru.
V roce 2010 tým Yaleovy univerzity vedený Dr. Yong Zhuem zjistil, že změny v epigenetice Clockova genu mohou vést ke zvýšenému riziku rakoviny prsu. Bylo zjištěno, že u žen s rakovinou prsu byla významně nižší metylace Clockova promotorového regionu. Bylo také zjištěno, že tento efekt byl větší u žen s estrogenovými a progesteronovými receptory negativními nádory.
Gen CLOCK může být také cílem somatických mutací u mikrosatelitů nestabilních karcinomů tlustého střeva a konečníku. Ve studii, kterou v roce 2010 provedli výzkumníci z Helsinské univerzity, obsahovalo 53% domnělých nových mikrosatelitů nestabilních cílových genů zodpovědných za karcinom tlustého střeva a konečníku mutace CLOCK.
Konstitutivní androstanový receptor –
Vazebný faktor jádra –
E2F –
Farnesoidní X receptor –
Kruppelovy faktory –
Nanog –
NF-kB –
Oct-4 –
P300/CBP –
Peroxisomový proliferátor aktivovaný –
PIT-1 –
Rho faktor –
R-SMAD –
Sigma faktor –
Sox2 –
Sp1 –
STAT protein
Základní-šroubovice-smyčka-šroubovice:
Aryl-uhlovodíkový receptor –
Hypoxií indukovatelné faktory –
MYC –
MyoD –
Myogenin –
Twist transkripční faktor
Základní leucinový zip:
Ccaat-enhancer-binding proteins –
CREB –
Základní leucinový zip se smyčkou helix-loop-helix:
Transkripční faktor asociovaný s mikroftalmií –
Sterolový protein vázající regulační prvek
Steroidní hormonální receptory
Typ I:
Glukokortikoidní receptor –
Mineralokortikoidní receptor –
Pohlavní hormonální receptor (Androgen receptor, Estrogen receptor, Progesteron receptor)
Typ II:
Calcitriol receptor –
Retinoid receptor (Retinoic acid receptor, Retinoid X receptor) –
Thyroid hormone receptor