Genový knockdown označuje experimentální techniku, při níž se snižuje exprese jednoho nebo více genů organismu. K redukci může dojít buď genetickou modifikací, nebo léčbou činidlem, jako je krátká DNA nebo RNA oligonukleotid, který má sekvenci doplňující buď gen, nebo transkript mRNA.
Gene Knockdowns vs. Transient Knockdowns
Pokud dojde ke genetické modifikaci DNA, výsledek se nazývá „knockdown organismus“. Pokud je změna genové exprese způsobena vazbou oligonukleotidu na mRNA nebo dočasnou vazbou na gen, vede to k dočasné změně genové exprese, která nemění chromozomální DNA, a výsledek se označuje jako „přechodný knockdown“.
Při přechodném knockdownu způsobuje vazba tohoto oligonukleotidu na aktivní gen nebo jeho transkripty sníženou expresi různými procesy. K vazbě může dojít buď blokováním transkripce (v případě genové vazby), degradací transkriptu mRNA (např. malým interferujícím RNA (siRNA) nebo antismyslem závislým na RNase-H), nebo blokováním buď translace mRNA, míst sestřihu před mRNA nebo míst štěpení nukleáz používaných pro zrání jiných funkčních RNA, včetně miRNA (např. morpholinskými oligy nebo jiným antismyslem nezávislým na RNase-H).)
Nejpřímější využití přechodných knockdownů je pro učení se o genu, který byl sekvenován, ale má neznámou nebo neúplně známou funkci. Tento experimentální přístup je známý jako reverzní genetika. Výzkumníci vyvozují závěry z toho, jak se knockdown liší od jedinců, u nichž je sledovaný gen funkční. Přechodné knockdowny se často používají ve vývojové biologii, protože oliga mohou být injekčně vpravena do jednobuněčných zygot a budou přítomna v dceřiných buňkách injekčně vpravené buňky během embryonálního vývoje.
Gene knockdown by RNAi Interference
RNA interference (RNAi) je prostředek k umlčení genů cestou degradace mRNA. Genový knockdown touto metodou je dosažen zavedením malých dvouvláknových interferujících RNA (siRNA) do cytoplazmy. Malé interferující RNA mohou vzniknout zevnitř buňky nebo mohou být exogenně zavedeny do buňky. Po zavedení do buňky jsou exogenní siRNA zpracovány komplexem tlumení indukovaným RNA (RISC). SiRNA je komplementární k cílové mRNA, která má být umlčena, a RISC používá siRNA jako šablonu pro lokalizaci cílové mRNA. Po lokalizaci RISC do cílové mRNA je RNA štěpena ribonukleátem.
RNAi se široce používá jako laboratorní technika pro genetickou funkční analýzu. RNAi v organismech, jako jsou C. elegans a Drosophila, poskytuje rychlý a levný prostředek pro zkoumání funkce genů. Ve výzkumu C. elegans dostupnost nástrojů, jako je Ahringerova RNAi knihovna, poskytuje laboratořím způsob testování mnoha genů v různých experimentálních zázemích. Poznatky získané z experimentálního použití RNAi mohou být užitečné při identifikaci potenciálních terapeutických cílů, vývoji léčiv nebo jiných aplikacích.
Dosud byly knockdown organismy s permanentními změnami v jejich DNA konstruovány hlavně pro výzkumné účely. Tyto organismy, známé také jednoduše jako knockdown, se nejčastěji používají pro reverzní genetiku, zejména u druhů, jako jsou myši nebo krysy, u kterých nelze snadno použít přechodnou knockdown technologii.
Existuje několik společností, které nabízejí komerční služby související s genovou knockdown léčbou. Sirion Biotech
je společnost, která poskytuje „garantované“ genové knockdown ve výši téměř 100%. Společnost také poskytuje svým klientům buněčné linie s vestavěnými reporterovými geny a buněčné modely příští generace s vysokým genovým knockdown. Bio-Synthesis nabízí stabilní a indukovatelné služby genového knockdown, které nabízejí zákazníkům možnost studovat funkci genů dynamickými způsoby.