Reverzní transkripční polymerázová řetězová reakce (RT-PCR) je jednou z mnoha variant polymerázové řetězové reakce (PCR). Tato technika se běžně používá v molekulární biologii k detekci hladin exprese RNA. RT-PCR je studenty i vědci často zaměňována s real-time polymerázovou řetězovou reakcí (qPCR). Jedná se však o samostatné a odlišné techniky. Zatímco RT-PCR se používá ke kvalitativní detekci genové exprese prostřednictvím vytvoření komplementárních DNA (cDNA) transkriptů z RNA, qPCR se používá ke kvantitativnímu měření amplifikace DNA pomocí fluorescenčních sond. qPCR se také označuje jako kvantitativní PCR, kvantitativní real-time PCR a real-time kvantitativní PCR.
Ačkoli RT-PCR i tradiční PCR produkují prostřednictvím amplifikace více kopií konkrétních izolátů DNA, aplikace obou technik se zásadně liší. Tradiční PCR se jednoduše používá k exponenciální amplifikaci daných sekvencí DNA. RT-PCR se používá ke klonování exprimovaných genů reverzní transkripcí sledované RNA do jejího DNA komplementu pomocí reverzní transkriptázy. Následně je nově syntetizovaná cDNA amplifikována pomocí tradiční PCR.
Kromě kvalitativně studijní genové exprese může být kvantitativní PCR využita pro kvantifikaci RNA, a to jak v relativním, tak absolutním vyjádření, začleněním qPCR do techniky. Kombinovaná technika, popisovaná jako kvantitativní RT-PCR nebo v reálném čase RT-PCR (někdy dokonce kvantitativní v reálném čase RT-PCR), je často zkrácena jako qRT-PCR, RT-qPCR nebo RRT-PCR. Ve srovnání s jinými metodami kvantifikace RNA, jako je severní blot, je qRT-PCR považována za nejsilnější, nejcitlivější a nejkvantitativnější test pro detekci hladin RNA. Často se používá při expresní analýze jednotlivých nebo více genů a expresních vzorců pro identifikaci infekcí a onemocnění.
Aby nedošlo k záměně, budou v celém článku důsledně používány následující zkratky:
Od svého zavedení v roce 1977 se Northern blot široce používal pro kvantifikaci RNA navzdory svým nedostatkům: a) časově náročná technika, b) vyžaduje velké množství RNA pro detekci a c) kvantitativně nepřesný v nízkém množství obsahu RNA. Objev reverzní transkriptázy během studia virové replikace genetického materiálu však vedl k vývoji RT-PCR, která od té doby vytlačila Northern blot jako metodu volby pro detekci a kvantifikaci RNA.
RT-PCR se stala srovnávací technologií pro detekci a/nebo srovnávání hladin RNA z několika důvodů: a) nevyžaduje následné zpracování PCR, b) lze měřit široký rozsah (>107krát) hojnosti RNA a c) poskytuje vhled do kvalitativních i kvantitativních údajů. Díky své jednoduchosti, specifičnosti a citlivosti se RT-PCR používá v širokém spektru aplikací od experimentů tak jednoduchých, jako je kvantifikace kvasinkových buněk ve víně, až po složitější použití jako diagnostické nástroje pro detekci infekčních agens, jako je virus ptačí chřipky.
V RT-PCR je RNA šablona nejprve převedena do komplementární DNA (cDNA) pomocí reverzní transkriptázy. cDNA je pak použita jako šablona pro exponenciální amplifikaci pomocí PCR. RT-PCR je v současné době nejcitlivější dostupnou metodou detekce RNA. Použití RT-PCR pro detekci RNA transkriptu způsobilo revoluci ve studiu genové exprese těmito důležitými způsoby:
Jednokroková RT-PCR vs. dvoukroková RT-PCR
Jednokroková vs dvoukroková RT-PCR
Kvantifikace mRNA pomocí RT-PCR lze dosáhnout buď jednofázovou, nebo dvoufázovou reakcí. Rozdíl mezi oběma přístupy spočívá v počtu zkumavek použitých při provádění postupu. Při jednofázovém přístupu dochází k celé reakci od syntézy cDNA až po amplifikaci PCR v jedné zkumavce. Na druhou stranu dvoufázová reakce vyžaduje, aby reverzní transkriptáza a amplifikace PCR byly provedeny v oddělených zkumavkách. Má se za to, že jednofázový přístup minimalizuje experimentální variace tím, že obsahuje všechny enzymatické reakce v jednom prostředí. Šablony pro výchozí RNA jsou však náchylné k degradaci při jednofázovém přístupu a použití tohoto přístupu se nedoporučuje, pokud jsou požadovány opakované zkoušky ze stejného vzorku. Navíc se uvádí, že jednofázový přístup je ve srovnání s dvoufázovým přístupem méně přesný. Je také preferovanou metodou analýzy při použití barviv vázajících DNA, jako je SYBR Green, protože eliminace primer-dimerů lze dosáhnout jednoduchou změnou teploty tání. Nevýhodou dvoukrokového přístupu je náchylnost ke kontaminaci v důsledku častější manipulace se vzorkem.
Konečný bod RT-PCR vs. real-time RT-PCR
Metody měření koncového bodu RT-PCR vyžadují detekci hladin genové exprese pomocí fluorescenčních barviv jako je ethidium bromid, značení PCR produktů pomocí fosforečnanu pomocí P32 nebo pomocí scintilačního počítání. Konečného bodu RT-PCR se běžně dosahuje pomocí tří různých metod: relativní, kompetitivní a srovnávací.
Relativní RT-PCR: Relativní kvantifikace RT-PCR zahrnuje koamplifikaci vnitřní kontroly současně se sledovaným genem. Vnitřní kontrola se používá k normalizaci vzorků. Po normalizaci lze provést přímé srovnání relativního počtu transkriptů ve více vzorcích mRNA. Jedním z preventivních opatření je, že vnitřní kontrola musí být zvolena tak, aby nebyla ovlivněna experimentálním zpracováním. Úroveň exprese by měla být konstantní ve všech vzorcích a se sledovanou mRNA, aby výsledky byly přesné a smysluplné. Protože kvantifikace výsledků se analyzuje porovnáním lineárního rozsahu cílové a kontrolní amplifikace, je rozhodující vzít před zahájením analýzy v úvahu výchozí koncentraci cílových molekul a jejich rychlost amplifikace. Výsledky analýzy se vyjadřují jako poměry genového signálu k vnitřnímu kontrolnímu signálu, které pak mohou být použity pro srovnání vzorků při odhadu relativní cílové exprese RNA.
Konkurenční RT-PCR: Konkurenční RT-PCR technika se používá pro absolutní kvantifikaci. Zahrnuje použití syntetické „konkurenční“ RNA, kterou lze odlišit od cílové RNA malým rozdílem ve velikosti nebo posloupnosti. Pro návrh syntetické RNA je důležité, aby byla shodná v pořadí, ale o něco kratší než cílová RNA pro přesné výsledky. Po navržení a syntéze se do experimentálních vzorků přidá známé množství konkurenční RNA, které se pomocí RT-PCR společně s cílovou RNA zesiluje. Poté se vytvoří křivka koncentrace konkurenční RNA, která se použije k porovnání signálů RT-PCR získaných z endogenních transkriptů pro stanovení množství cílové RNA přítomné ve vzorku.
Srovnávací RT-PCR: Srovnávací RT-PCR je podobná kompetitivní RT-PCR v tom, že cílová RNA soutěží o amplifikační činidla v rámci jedné reakce s vnitřním standardem nesouvisející sekvence. Po dokončení reakce jsou výsledky porovnány s křivkou externího standardu pro stanovení cílové koncentrace RNA. Ve srovnání s relativními a kompetitivními metodami kvantifikace je komparativní RT-PCR považována za nejvhodnější metodu, protože nevyžaduje, aby zkoušející provedl pilotní experiment; v relativní RT-PCR musí být předem určen exponenciální rozsah amplifikace mRNA a v kompetitivní RT-PCR musí být syntetizována RNA syntetického konkurenta.
Vznik nových technik značení fluorescenční DNA v posledních několika letech umožnil analýzu a detekci PCR produktů v reálném čase a následně vedl k rozsáhlé adaptaci RT-PCR v reálném čase pro analýzu genové exprese. RT-PCR v reálném čase je nyní nejen metodou volby pro kvantifikaci genové exprese, ale je také preferovanou metodou získávání výsledků z maticových analýz a genových expresí v celosvětovém měřítku. V současné době jsou k dispozici čtyři různé fluorescenční DNA sondy pro detekci PCR produktů v reálném čase RT-PCR: SYBR Green, TaqMan, Molecular Beacons a Scorpions. Všechny tyto sondy umožňují detekci PCR produktů generováním fluorescenčního signálu. Zatímco SYBR Green barvivo vysílá svůj fluorescenční signál jednoduše vazbou na dvouvláknovou DNA v roztoku, TaqMan sondy, Molekulární majáky a Scorpions generování fluorescence závisí na Förster Resonance Energy Transfer (FRET) vazbě molekuly barviva a frekvence na oligonukleotidové substráty.
Pro kvantifikaci výsledků získaných metodou RT-PCR v reálném čase se běžně používají dvě strategie; standardní křivková metoda a srovnávací prahová metoda.
Exponenciální amplifikace pomocí zpětné transkripční polymerázové řetězové reakce poskytuje vysoce citlivou techniku, při níž lze detekovat velmi nízký počet kopií molekul RNA. RT-PCR je široce využívána při diagnostice genetických onemocnění a semikvantitativně při určování množství specifických různých molekul RNA v buňce nebo tkáni jako měřítko genové exprese.
RT-PCR se běžně používá ve výzkumných metodách k měření genové exprese. Například Lin a kol. používali qRT-PCR k měření exprese genů Gal v kvasinkových buňkách. Nejprve Lin a kol. vytvořili mutaci proteinu, u kterého bylo podezření, že se podílí na regulaci genů Gal. Tato mutace byla hypoteticky selektivně zrušena exprese Gal. K potvrzení této skutečnosti byly pomocí qRT-PCR analyzovány hladiny genové exprese kvasinkových buněk obsahujících tuto mutaci. Výzkumníkům se podařilo přesvědčivě určit, že mutace tohoto regulačního proteinu snižovala expresi Gal. Analýza Northern blot se používá k dalšímu studiu genové exprese RNA.
RT-PCR může být také velmi užitečná při vkládání eukaryotických genů do prokaryot. Protože většina eukaryotických genů obsahuje introny, které jsou přítomny v genomu, ale ne ve zralé mRNA, je cDNA generovaná z reakce RT-PCR přesnou (bez ohledu na chybový charakter reverzních transkriptáz) sekvencí DNA, která by byla po transkripci přímo přeložena do proteinu. Když jsou tyto geny exprimovány v prokaryotických buňkách kvůli produkci nebo purifikaci proteinů, nemusí RNA produkovaná přímo z transkripce projít splicingem, protože transkript obsahuje pouze exony. (Prokaryoty, jako je E. coli, postrádají mechanismus splicingu mRNA eukaryot).
RT-PCR se běžně používá při studiu genomů virů, jejichž genomy jsou složeny z RNA, jako je například Influenzavirus A a retroviry jako HIV.
RT-PCR může být použita k diagnostice genetického onemocnění, jako je Lesch-Nyhanův syndrom. Toto genetické onemocnění je způsobeno poruchou v genu HPRT1, která klinicky vede k fatálnímu močovému kameni kyseliny močové a příznakům podobným dně. Analýza těhotné matky a plodu na hladiny exprese mRNA HPRT1 odhalí, zda je matka přenašečkou a zda se u plodu pravděpodobně vyvine Lesch-Nyhanův syndrom.
Vědci pracují na způsobech využití RT-PCR při detekci nádorů, které by pomohly zlepšit prognózu a monitorovat reakci na terapii. Cirkulující nádorové buňky produkují unikátní transkripty mRNA v závislosti na typu nádoru. Cílem je určit, které transkripty mRNA slouží jako nejlepší biomarkery pro konkrétní typ nádorové buňky a následně analyzovat úroveň jeho exprese pomocí RT-PCR.
RT-PCR se běžně používá při studiu genomů virů, jejichž genomy se skládají z RNA, jako je například Influenzavirus A a retroviry jako HIV.
RT-PCR může být provedena jednokrokovým protokolem RT-PCR nebo dvoukrokovým protokolem RT-PCR.
Jednokroková RT-PCR odebere mRNA cíle (až 6 kb) a podrobí je reverzní transkripci a poté PCR amplifikaci v jedné zkumavce. Pro nejlepší výsledky používejte pouze neporušenou, vysoce kvalitní RNA. Ujistěte se, že použijete sekvenční primer.
(PCR aplikace manuální a Biotools)
Dvoufázová RT-PCR, jak název napovídá, probíhá ve dvou krocích. Nejprve reverzní transkripce a poté PCR. Tato metoda je citlivější než metoda jednofázová. Kity jsou užitečné i pro dvoufázovou RT-PCR. Stejně jako pro jednofázovou metodu používejte pro nejlepší výsledky pouze neporušenou, vysoce kvalitní RNA. Primár pro dvoufázovou metodu nemusí být sekvenční.
Kvantitativní RT-PCR metoda je považována za zlatý standard pro měření počtu kopií specifických cDNA cílů ve vzorku, ale je špatně standardizovaná. Výsledkem je, že zatímco existuje mnoho publikací využívajících tuto techniku, mnohé poskytují nedostatečné experimentální detaily a používají nevhodnou analýzu dat k vyvození nevhodných závěrů. Vzhledem k vrozené variabilitě kvality jakýchkoli kvantitativních PCR dat mají recenzenti nejen obtížný čas na vyhodnocení těchto rukopisů, studie se také stávají nemožnými k replikaci. Vzhledem k potřebě standardizace vykazování experimentálních podmínek, Minimální informace pro publikaci kvantitativních experimentů PCR v reálném čase (MIQE, pronounced mykee) pokyny byly publikovány mezinárodním konsorciem akademických vědců. Pokyny MIQE popisují minimální informace nezbytné pro hodnocení kvantitativních experimentů PCR, které by měly být vyžadovány pro publikaci pro podporu lepší experimentální praxe a zajištění relevance, přesnosti, správné interpretace a opakovatelnosti kvantitativních dat PCR.
Kromě pokynů pro podávání zpráv zdůrazňuje MIQE potřebu standardizovat nomenklaturu spojenou s kvantitativní PCR, aby nedošlo k záměně; například zkratka qPCR by se měla používat pro kvantitativní PCR v reálném čase a RT-qPCR by se měla používat pro reverzní transkripci-qPCR a geny používané pro normalizaci by se měly označovat jako referenční geny místo genů pro vedení domácnosti. Navrhuje se také, aby se komerčně odvozené termíny jako TaqMan® sondy nepoužívaly, ale místo toho se označovaly jako hydrolyzační sondy. Dále se navrhuje, aby se kvantifikační cyklus (Cq) používal k popisu PCR cyklu používaného pro kvantifikaci místo prahového cyklu (Ct), bodu přechodu (Cp) a bodu vzletu (TOP), které odkazují na stejnou hodnotu, ale byly vytvořeny různými výrobci přístrojů v reálném čase.
Pokyn se skládá z těchto prvků: 1) experimentální návrh, 2) vzorek, 3) extrakce nukleové kyseliny, 4) reverzní transkripce, 5) cílová informace qPCR, 6) oligonukleotidy, 7) protokol, 8) validace a 9) analýza dat. Konkrétní položky v rámci každého prvku nesou označení buď E (podstatné), nebo D (žádoucí). Ty, které jsou označeny jako E, jsou považovány za kritické a nepostradatelné, zatímco ty, které jsou označeny jako D, jsou považovány za okrajové, avšak důležité pro osvědčené postupy.